《Cancer Biology & Therapy》：Adaptive kinase signaling enables escape from small molecule inhibition in glioblastoma
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目的：胶质母细胞瘤（GB）患者在经过手术切除、放疗和化疗的强化治疗后，中位生存期仅为15个月。克服治疗耐药的主要挑战在于瘤内异质性，其特征为分子、表型和临床多样性。小分子抑制剂（SMIs）靶向特定致癌信号通路，已在多种分子定义的癌症中成为成功疗法。然而在GB中
目的：胶质母细胞瘤（GB）患者在经过手术切除、放疗和化疗的强化治疗后，中位生存期仅为15个月。克服治疗耐药的主要挑战在于瘤内异质性，其特征为分子、表型和临床多样性。小分子抑制剂（SMIs）靶向特定致癌信号通路，已在多种分子定义的癌症中成为成功疗法。然而在GB中，SMIs迄今未能显著改善患者预后。本研究利用患者来源的胶质母细胞瘤类器官（PGO）平台探究驱动靶向治疗耐药的适应性旁路信号机制。方法：选取六例原发性PGO，分别用九种FDA批准的可透过血脑屏障且靶向GB关键驱动基因的SMIs进行处理。通过细胞活力检测和IC??测定评估药物敏感性。为鉴定代偿性信号机制，在单药治疗后进行激酶活性谱分析。结果：尽管抑制下游效应蛋白（IC??：70 nM–1 μM）比抑制上游受体酪氨酸激酶（IC??：1–15 μM）更有效地降低细胞活力，但所有PGO中仍存在残余增殖。激酶谱分析揭示了单药治疗后的代偿性通路激活，从而能够鉴定有效的SMI联合方案。最显著的联合方案分别使用CHIR99021和trametinib靶向糖原合成酶激酶-3（GSK-3）和丝裂原活化蛋白激酶激酶（MEK）。结论：这些发现表明适应性旁路信号限制了GB中单药SMI的疗效。基于PGO的激酶谱分析能够鉴定耐药机制和合理的联合治疗方案，支持其在个体化治疗开发中的应用。
胶质母细胞瘤（GB）是成人中最常见的恶性原发性脑肿瘤。标准治疗方案包括最大程度手术切除，随后进行放化疗及替莫唑胺（TMZ）辅助化疗，但该多模式治疗的生存获益仍然有限，90%的患者最终出现复发。复发阶段尚无延长生命的治疗方法，中位总生存期不足6个月。尽管开展了包括免疫检查点抑制剂在内的多项临床试验，GB患者均未获得生存获益。GB治疗的重要挑战在于瘤内异质性，即存在表型不同的GB亚克隆，这些亚克隆以各自的驱动突变为特征，如神经祖细胞样（NP-like）、少突胶质祖细胞样（OPC-like）、星形胶质细胞样（AC-like）和间充质样（MES-like）状态，阻碍了单药的有效性。AC-like亚型以表皮生长因子受体（EGFR）突变或扩增为特征，OPC-like肿瘤以血小板衍生生长因子受体（PDGFR）扩增为特征，二者均激活下游RAS/RAF通路。该RAS/RAF通路在间充质样肿瘤中也常因肝细胞生长因子受体（c-MET）扩增而上调。此外，肿瘤抑制基因磷酸酶和张力蛋白同源物（PTEN）在经典型、神经型和间充质型肿瘤中的突变、缺失和表达降低，通过磷脂酰肌醇3-磷酸（PIP?）扩增导致AKT激活。最后，在经典型、神经型和间充质型GB中，小鼠双微体2同源物（MDM2/4）频繁扩增，导致这些肿瘤中TP53泛素化增加和降解。这些不同的细胞状态常共存于同一肿瘤中，凸显了GB深刻的瘤内异质性以及开发泛GB有效疗法的挑战。治疗后，GB可通过克隆选择发生进一步的基因组改变，使耐药亚克隆得以存续并最终驱动复发和治疗耐药。多种SMIs已被证明可在体外降低GB细胞模型的细胞活力，如afatinib（EGFR抑制剂）、abemaciclib（CDK4/CDK6抑制剂）、buparlisib（PI3K抑制剂）、vistusertib（mTOR抑制剂）、cediranib（VEGFR/c-KIT/PDGFRβ抑制剂）和costunolide（TERT抑制剂）。然而，这些SMIs在临床试验中未能改善总生存期，导致新诊断GB患者的标准治疗自2005年以来未发生变化。来自体外模型和临床研究的大量证据表明，癌症对SMIs存在内在和获得性耐药。例如，在非小细胞肺癌中，患者常在治疗第一年内对EGFR抑制剂产生耐药，多由代偿性信号驱动，如c-MET扩增和RAS/RAF及PI3K/AKT通路突变。这些耐药机制可通过c-MET或MEK联合抑制来应对，凸显了联合治疗的价值。在GB中，多条通路的同时激活可能是TKIs反应不佳的基础，多项受体酪氨酸激酶（RTKs）的联合抑制已被证明能更有效地降低GB细胞模型的细胞活力。重要的旁路机制包括EGFR抑制后MET或AXL的上调以及PI3K/mTOR与MEK/ERK通路之间的交叉对话。基因工程和异种移植模型进一步证明这种代偿性信号可在体内发生。例如，在基因工程EGFR驱动的GBM模型中，EGFR抑制诱导MET表达，而EGFR/MET联合抑制克服了该耐药机制。类似地，PI3K和MEK联合抑制克服了基因工程和患者来源异种移植模型中的适应性激酶组回路。遗憾的是，临床试验尚未带来生存改善和新获批治疗，可能是由于对健康组织的剂量限制性毒性、局部药物疗效有限以及使用未分层患者群体。因此，临床需要生物标志物驱动的个体化临床试验中鉴定合理有效的联合治疗。作为第一步，研究人员使用已批准的能透过血脑屏障的SMIs靶向GB中最突出的致癌驱动因素，利用患者来源的胶质母细胞瘤类器官（PGOs）研究单药和联合治疗的效果。这些GB类器官类似于亲本肿瘤的表型和基因型特征，并在培养中维持其瘤内遗传和表型异质性。研究人员证明每个PGO对所选SMIs的反应不同，对应于独特的代偿性磷酸激酶谱。靶向这些代偿性激酶调节的合理药物组合以患者特异性方式降低细胞活力。
研究人员评估了一组经过遗传学表征的患者来源GB类器官（PGOs），以探究激酶通路依赖性及对临床批准SMIs的适应性反应。在所有PGO模型中，均实现了靶向通路抑制，但通路抑制程度和生长抑制效果差异显著。重要的是，单药治疗诱导了PGO特异性的代偿性信号，使得能够鉴定可操作的旁路节点和合理组合以减轻适应性耐药。在该panel中，靶向下游信号效应器的抑制剂（abemaciclib、trametinib和buparlisib）通常比上游RTK抑制剂（即afatinib和capmatinib）产生更一致的通路抑制和活力降低。这一发现与以下概念一致：与RTK导向的抑制相比，下游阻断可约束汇聚的致癌输入并减少通路冗余，后者更易受受体水平旁路的影响。然而，仅凭基因组改变不足以预测这些模型中的药物依赖性。这可能反映两个主要因素。第一，多个共现突变和动态转录程序可随时间重编程致癌信号，使靶向抑制得以适应。SMIs因此可能产生快速但短暂的反应，因为信号网络通过释放负反馈和激活代偿通路进行适应，最终恢复下游信号。第二，GB细胞群体具有异质性，预先存在的反应较差的克隆可能在治疗中存活并驱动耐药细胞状态的生长。在EGFR突变NSCLC中，对EGFR TKIs的获得性耐药是一个动态过程，由继发性EGFR突变（如T790M）、MET扩增和表型转换驱动，偶尔出现药物敏感性回复。在临床上，合理组合的获益以复发NSCLC中EGFR加MET抑制为例证。这些发现强调了在设计分层策略和联合试验（如药物再发现方案研究DRUP）时，功能通路映射补充基因组分析的重要性。重要的是，研究人员在所有PGO模型中观察到SMIs的有效靶点抑制，值得进一步研究以确定这些抑制剂用于GB患者的最佳治疗计划和组合。一项GB的0期临床试验已证明，CDK4/6抑制剂ribociclib在脑脊液和肿瘤中达到体外IC50的五倍浓度，表明中枢神经系统/肿瘤穿透不足并非疗效有限的唯一障碍。相反，适应性重编程和瘤内异质性可迅速降低靶点依赖性。例如，CDK4/6抑制通过核因子κB（NF-κB）信号在GB中激活c-MET和原肌球蛋白受体激酶A-B（TrkA-B）通路。此外，CDK4/6抑制导致MAPK和PI3K/AKT通路的代偿性激活，表明存在强化细胞存活的反馈回路。这一观察与研究人员发现的abemaciclib处理后p-ERK水平上调一致。有趣的是，abemaciclib处理还导致所有测试PGO中总Rb蛋白水平降低。由于abemaciclib使Rb蛋白维持在与E2F结合的低磷酸化状态，游离E2F的可利用性可能降低。鉴于RB1启动子含有E2F结合位点，E2F可利用性降低可能减弱RB1基因自身的转录激活，从而促成观察到的总Rb蛋白水平降低。总之，这些发现说明了单信号节点的抑制如何通过平行通路的代偿性激活而被规避。这种适应性可塑性支持靶向主要致癌驱动因素和通路再激活机制的联合策略。事实上，同一信号级联中多个水平的同时抑制可实现更持久的通路抑制并限制促进治疗耐药的代偿性反馈机制。这一原则是BRAF V600突变转移性黑色素瘤当前标准治疗的基础，并已获批用于BRAF V600突变非小细胞肺癌和儿童胶质瘤。在GBM中，BRAF V600改变频率要低得多，约在3%–5%的肿瘤中检测到，联合BRAF/MEK抑制的临床活性仍然有限，研究报告的缓解率约为33%。然而，dabrafenib对野生型BRAF不具有相同的抑制作用，反而可促进RAF二聚体的反常激活，导致下游MAPK信号增加。与先前在胶质瘤模型中的观察一致，研究人员在BRAF野生型GB模型中观察到dabrafenib处理后ERK磷酸化增加。当考虑与其他MAPK抑制剂联合时，这种反常激活可能尤为重要，因为dabrafenib可能抵消BRAF野生型肿瘤中BRAF下游的抑制。MEK抑制后观察到类似的适应性反应。Trametinib在所有PGO模型中诱导MEK Ser217/221的显著超磷酸化，表明通过未知级联对上游MAPK信号的代偿性激活。值得注意的是，MEK磷酸化的增加并未恢复下游ERK信号，可能是通过阻止ERK激活所需的MEK双磷酸化实现的。靶向驱动这种代偿性MEK磷酸化的上游信号并与trametinib联合可能提供更持久的MAPK抑制并增强治疗效果。为进一步探究GB中垂直抑制策略的潜力，研究人员检测了afatinib、trametinib和abemaciclib在两种PGO中的组合。与上游RTK抑制相比，trametinib在两种PGO中诱导更显著的pERK水平降低。Afatinib在PGO 1919中选择性但不完全降低pERK，表明PGO模型之间对上游受体信号的依赖性存在差异。有趣的是，afatinib在所有六种PGO中一致增加总EGFR蛋白水平，尽管降低了EGFR磷酸化。EGFR丰度与激活之间的类似分离已在EGFR-TKI治疗后描述，可能反映激酶抑制后受体运输或周转的改变。一项GB的II期临床试验获得了类似结果，患者接受EGFR抑制剂gefitinib治疗，初始在肿瘤组织中发现了高浓度药物并实现了EGFR的靶向抑制，但药物未能随后下调MAPK通路。此外，gefitinib的有效性与EGFR突变状态不相关，表明涉及其他ERBB家族成员和TKRs（如MET和PDGFR）的信号网络因其模块化组织和调控回路的冗余性而具有稳健性。EGFR或MEK抑制单独均不足以完全诱导细胞周期停滞，支持将这些药物与CDK4/6抑制联合以实现增强抗增殖效果的理由。值得注意的是，CDK4/6阻断诱导ERK超磷酸化，可被MEK抑制剂共处理有效抵消。在PGO 1919中，afatinib更有效地减弱abemaciclib诱导的ERK超磷酸化。这些观察表明CDK4/6抑制通过上游RTK激活重新激活MAPK通路。类似的反馈机制已在头颈部鳞状细胞癌中描述，CDK4/6抑制诱导ERK超磷酸化并被trametinib逆转；在ER阳性乳腺癌中，CDK4/6阻断后EGFR和HER2介导ERK再激活。重要的是，MEK和CDK4/6联合抑制在PGO 030中具有协同作用，但在PGO 1919中则不然。这可能反映PGO 1919对EGFR或MEK抑制剂单药治疗具有更大的依赖性，单药已产生显著的抗增殖效果。磷酸激酶谱分析揭示了abemaciclib、buparlisib或trametinib处理后AKT/GSK3/CREB轴的PGO特异性重编程，其中GSK3β显示出最大变异。在PGO 031中，长时间SMI暴露增加了抑制性GSK3βSer9磷酸化，而在PGO 009和PGO 027中该反应较不明显。GSK3β调节在短期和长期治疗之间也存在差异，表明存在时间动态。在功能上，GSK3β抑制在PGO 031中拮抗trametinib，但在PGO 009和PGO 027中具有协同作用。因此，GSK3β并非统一的耐药机制；其贡献取决于个体GBM模型的适应性信号状态。PGO 031中trametinib与CHIR99021之间的拮抗相互作用可能由WNT/β-catenin信号的反馈激活解释。GSK3β是WNT的核心负调控因子，它磷酸化β-catenin并促进其降解。GSK3β的抑制，无论是通过AKT介导的Ser9磷酸化还是通过药理学阻断，均阻止其激酶活性、稳定β-catenin并激活WNT通路。这种WNT信号激活已知可增强GB中的干性和治疗耐药。与此一致，先前报道显示MEK抑制可触发通过PI3K/AKT的适应性信号，导致GSK3β Ser9的抑制性磷酸化、β-catenin的核积累和干性程序的上调。另一项研究表明CHIR99021抑制GSK3β可促进干样表型并显著增加类器官大小。在本研究中，trametinib在PGO 031中特异性诱导AKT激活和GSK3β Ser9磷酸化，为观察到的与GSK3β抑制剂联合时的拮抗作用提供了机制解释。这一发现得到以下观察的支持：GSK3β抑制促进GB PGO中更大更紧密的3D细胞簇形成，这可能反映干性和自我更新能力的增强。虽然本研究中探索的特定药物组合是新的，但先前一项研究已探究了CHIR99021和trametinib的组合。与单药治疗相比，该双药治疗更有效地减少了小鼠原位人PDAC异种移植瘤的生长。除此以外，其他基于GSK3β抑制剂的组合在多种癌症类型中显示出前景。例如，GSK3β和聚ADP-核糖聚合酶（PARP）联合抑制在遗传多样性结直肠癌细胞系panel中表现出强协同作用。在另一项研究中，GSK3抑制剂LY2090314与间变性淋巴瘤激酶（ALK）抑制剂lorlatinib在中等耐药ALK阳性NSCLC细胞中具有协同作用。这些发现突出了GSK3β在GB中的背景依赖性作用。进一步研究解析GB中MEK、PI3K/AKT和WNT信号之间的相互作用对于识别联合通路抑制具有治疗获益而非有害的亚组至关重要。本研究存在若干局限性。机制性Western blot实验中使用的药物浓度可能超过临床可达到的暴露量，可能增加脱靶效应并限制转化相关性。研究人员注意到，细胞活力实验中使用的浓度则在临床相关范围内。MEKi avutometinib、EGFRi gefitinib和CDK4/6i ribociclib的临床药代动力学研究报告GB组织中未结合药物浓度超过本研究中描述的IC50值。需要进一步开展SMIs在GB脑腔室中的药物遗传学和药代动力学研究，以确定联合治疗的最佳给药策略。此外，联合三种SMIs的毒性可能显著，潜在的临床相关联合方案应在I期临床试验中仔细测试。然而，本研究的主要目的是揭示代偿性信号网络并提出合理组合，而非确定临床给药方案。第二个局限性是队列规模，阻碍了稳健的基因型-反应结论并限制了泛化。未来研究应扩大功能谱分析至更多模型并整合正交读数（如磷酸化蛋白质组学和单细胞分析），以完善适应性重编程的预测特征并优先选择最可能在临床可行暴露下维持通路抑制的组合。当前的患者分层策略通常关注单一驱动突变并依赖有限的时间采样来指导治疗决策，仅提供有限获益。研究人员的发现提供了分子见解，支持以下观点：按单一驱动突变对患者进行分层是不够的，因为耐药、异质性和通路激活由更广泛的突变背景驱动。实现SMI治疗的持久获益需要精确的患者分层、时间监测和合理的SMIs组合以抑制代偿性信号并改善临床反应。总之，研究人员的数据支持一个在临床相关患者模型中鉴定复杂药物反应的平台。这些代偿性反应的机制解析可揭示可操作的旁路节点并指导合理组合，目标是提高GB中靶向干预的持久性。
关键技术方法：本研究使用六例患者来源的胶质母细胞瘤类器官（PGOs），其中四例（U1242、1919、3565和3128）由合作研究组提供，PGO 009、027、030、031等来源于Maastricht University Medical Center+和Zuyderland Medical Center手术切除标本（研究注册号NCT04865315和NCT04865396）。主要技术方法包括：细胞活力检测（CellTiter-Glo 3D和Alamar Blue）及IC??测定、Western blot分析、磷酸激酶阵列分析（Proteome Profiler Human Phospho-Kinase Array和Phospho-RTK Array）、基因表达谱分析（GEPIA/TCGA/GTEx）、长期药物暴露实验及流式细胞术（PI染色）活力评估、协同评分分析（SynergyFinder+，Bliss评分）。
研究结果：（1）药物筛选：九种SMIs在六种遗传多样性PGO上测试，五种抑制剂（abemaciclib、afatinib、axitinib、buparlisib和trametinib）在所有PGO中IC??低于2 μM；靶向下游效应蛋白的抑制剂IC??低于靶向上游RTK的抑制剂；IC??变异与突变状态无相关性。（2）靶点有效性：abemaciclib、afatinib、buparlisib和trametinib（1 μM）降低了相应下游靶点的激活；abemaciclib降低总Rb并完全阻断phospho-Rb；trametinib处理后phospho-MEK Ser217/221超磷酸化而下游phospho-ERK不可检测；dabrafenib处理增加所有PGO中phospho-ERK水平。（3）MAPK通路的联合抑制：abemaciclib处理导致PGO 1919和030中phospho-ERK上调，可被trametinib或afatinib共处理阻断；afatinib或trametinib与abemaciclib联合时phospho-ERK和phospho-Rb降低更显著；PGO 030中trametinib（0.01 μM）与abemaciclib（1 μM）显示协同作用（Bliss评分10），加入afatinib后协同评分增至14，但三药联合在PGO 1919中无协同作用。（4）磷酸化激酶组变化：PCA显示两种PGO独立聚类及各自治疗亚聚类；欧氏层次聚类将SMI处理的PGO分为五个蛋白簇，簇#2富集AKT/GSK3/CREB通路活性，在PGO 031中强上调而在PGO 009中下调；GSK-3β Ser9磷酸化差异最大，在PGO 031中激活而在PGO 009中未激活。（5）GSK-3β抑制的联合治疗：CHIR99021单药仅在10 μM时降低所有PGO的细胞活力；CHIR99021与buparlisib、abemaciclib或trametinib联合未进一步降低细胞活力；Bliss评分显示CHIR99021与测试SMIs之间无协同相互作用，例外为PGO 009和027中1 μM CHIR99021联合0.1 μM trametinib显示协同，PGO 027中1 μM CHIR99021联合abemaciclib显示协同，这些协同相互作用在PGO 031中未观察到。（6）GSK-3β抑制的长期活力实验：PGO 031中trametinib单药导致剂量依赖性活细胞数降低，CHIR99021单药影响极小但促进类器官形成和增加3D结构复杂性；CHIR99021共处理以剂量依赖性方式逆转trametinib效果，表明MEK和GSK3β抑制之间的拮抗相互作用；低剂量trametinib主要表现为细胞抑制而非细胞毒性；U87中trametinib和CHIR99021联合导致比单药更显著的活力降低（Bliss评分>10），而U1242对CHIR99021单药敏感且trametinib无额外获益，显示细胞模型依赖性反应。
讨论部分总结：本研究评估了一组遗传学表征的PGOs以探究激酶通路依赖性和对临床批准SMIs的适应性反应。单药治疗诱导了PGO特异性代偿性信号，使得能够鉴定可操作的旁路节点和合理组合。下游效应器抑制剂比上游RTK抑制剂产生更一致的通路抑制和活力降低。基因组改变不足以预测药物依赖性，反映共现突变和动态转录程序导致信号重编程以及异质性细胞群体中预存耐药克隆的存续。CDK4/6抑制诱导ERK超磷酸化，可被MEK抑制剂抵消。磷酸激酶谱揭示AKT/GSK3/CREB轴的PGO特异性重编程，GSK3β Ser9磷酸化差异最大。GSK3β抑制在PGO 031中拮抗trametinib但在PGO 009和027中协同，表明GSK3β并非统一耐药机制。PGO 031中拮抗可能由GSK3β抑制稳定β-catenin激活WNT通路解释。研究局限性包括机制实验中药物浓度可能超过临床可达暴露量以及队列规模有限。研究支持按单一驱动突变分层不足，实现持久获益需要精确患者分层、时间监测和合理SMIs组合。研究结论：这些发现表明适应性旁路信号限制了GB中单药SMI的疗效。基于PGO的激酶谱分析能够鉴定耐药机制和合理联合治疗，支持其在个体化治疗开发中的应用。
