NSUN4介导的JAK1 mRNA m5C甲基化促进肝细胞癌恶性进展的机制研究

《Cell Adhesion & Migration》：NOP2/Sun domain 4-mediated m5C methylation of Janus kinase 1 promotes hepatocellular carcinoma progression

5-甲基胞嘧啶（m5C）修饰与多种肿瘤相关，但NOP2/Sun结构域家族成员4（NSUN4）介导的m5C修饰在肝细胞癌（HCC）中的作用尚不明确。本研究中，NSUN4在HCC中显著上调，并与不良生存相关。沉默NSUN4可抑制HCC细胞增殖、迁移、侵袭及肿瘤生长。机制上，NSUN4通过m5C甲基化增强Janus激酶1（JAK1）mRNA的稳定性与表达，激活JAK-STAT3信号通路并驱动恶性进展。因此，NSUN4通过m5C依赖的JAK1稳定化及JAK-STAT3激活促进HCC进展，提示NSUN4是HCC的潜在治疗靶点。

研究背景 肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是全球常见恶性肿瘤，占原发性肝癌的75%–85%。早期接受手术干预的患者5年生存率可超过70%，但由于缺乏有效早期筛查手段，多数患者确诊时已处晚期，预后不佳且治疗选择受限。近年来靶向治疗与检查点抑制剂已用于晚期HCC，但临床研究显示其缓解率低、总生存获益有限，因此深入探索晚期HCC的分子机制对设计更有效治疗策略十分必要。RNA甲基化修饰是转录后调控的重要表观遗传修饰，参与多种生物学过程。5-甲基胞嘧啶（5-methylcytosine，m⁵C）作为普遍存在的RNA甲基化修饰，可调控RNA剪接、核输出、稳定性与翻译，其水平由甲基转移酶及结合蛋白调控，已知的m⁵C RNA甲基转移酶主要包括NOP2/SUN RNA甲基转移酶家族成员1–7（NSUN1-7）及DNA甲基转移酶家族（DNMTs）。已有研究显示m⁵C修饰影响肿瘤发生、维持与进展，并可能成为肿瘤治疗靶点；HCC中m⁵C丰度显著高于癌旁正常组织，NSUN2等m⁵C调控因子参与HCC细胞周期、代谢及索拉非尼敏感性调控。NSUN4作为m⁵C甲基转移酶家族成员，在肺癌、肾癌及HCC等肿瘤中异常表达，既往研究显示其在HCC中显著过表达，但NSUN4驱动的RNA m⁵C修饰在HCC中的作用及机制尚未阐明，故开展本研究。

研究概况 研究人员发现NSUN4在HCC中过表达并与患者预后相关，功能实验证实NSUN4促进HCC恶性进展；进一步鉴定JAK1为NSUN4介导m⁵C修饰的靶分子，其可激活JAK-STAT3信号通路磷酸化，进而促进HCC恶性表型。该研究揭示了NSUN4介导的m⁵C修饰在HCC中的作用及调控机制，提示NSUN4是HCC潜在治疗靶点。

关键技术方法 收集厦门大学附属第一医院2021–2023年20对HCC组织及癌旁非癌肝组织临床样本；采用HepG2、Hep3B、HCCLM3、Huh7及正常肝细胞MIHA进行细胞实验；通过RNA免疫沉淀（RIP）检测m⁵C修饰；以放线菌素D处理结合qRT-PCR进行RNA稳定性检测；采用CCK-8、克隆形成、划痕愈合、Transwell侵袭及流式细胞术凋亡检测评估细胞表型；构建BALB/c裸鼠皮下成瘤模型（15只，每组6只）进行体内验证；结合UALCAN、CPTAC、GEPIA、TCGA-LIHC等数据库及KEGG通路分析。

研究结果

NSUN4在HCC中上调并与患者预后相关：UALCAN数据库显示NSUN4 mRNA在HCC中显著上调；qRT-PCR证实20对HCC组织中NSUN4 mRNA高于癌旁组织；CPTAC数据库显示NSUN4蛋白水平显著升高；Western blot与免疫组化（IHC）验证20对HCC组织中NSUN4蛋白上调；4种HCC细胞系中NSUN4蛋白水平高于正常肝细胞MIHA；GEPIA数据库Kaplan–Meier分析显示NSUN4高表达患者总生存期更短。

NSUN4增强HCC细胞恶性潜能：转染NSUN4 siRNA后，si-NSUN4#1抑制效果最显著并被选用；CCK-8显示敲低NSUN4降低HCCLM3与Huh-7细胞增殖；克隆形成实验显示集落数减少；划痕愈合与Transwell实验显示迁移和侵袭能力受抑；流式细胞术显示敲低NSUN4显著增强细胞凋亡。

NSUN4调控JAK1 mRNA m⁵C甲基化并增强其稳定性与翻译：KEGG分析显示与NSUN4正相关基因富集于化学致癌-受体激活、癌症通路及PI3K-Akt信号通路，负相关基因富集于胆固醇代谢与PPAR信号通路；JAK1与NSUN4正相关（Pearson相关系数0.73）；UALCAN显示JAK1在HCC中显著升高；敲低NSUN4后JAK1 mRNA与蛋白水平明显下降，STAT3磷酸化水平受抑；m⁵C-RIP结合qRT-PCR证实JAK1 mRNA被m⁵C抗体富集，且NSUN4缺失降低JAK1的m⁵C修饰；放线菌素D实验显示沉默NSUN4明显缩短JAK1 mRNA半衰期。

JAK1对NSUN4介导的HCC细胞恶性潜能不可或缺：构建JAK1过表达质粒并经Western blot验证；回复实验显示，NSUN4敲低细胞的增殖下降可被JAK1过表达逆转；划痕愈合与Transwell实验显示NSUN4敲低所致迁移和侵袭下降可被JAK1过表达抵消；流式细胞术显示JAK1过表达显著逆转NSUN4敲低诱导的凋亡增加。

NSUN4通过激活JAK1-STAT3信号通路促进HCC生长：建立NC、LV-sh-NSUN4+vector、LV-sh-NSUN4+oe-JAK1三组HCCLM3皮下成瘤模型；敲低NSUN4组肿瘤体积与重量较NC组明显减小，JAK1过表达逆转该抑制效应；IHC显示敲低NSUN4组Ki-67等增殖指标降低，JAK1过表达可恢复；Western blot显示敲低NSUN4抑制JAK1与p-STAT3表达，过表达JAK1重新激活JAK1-STAT3通路。

讨论与结论 讨论指出，HCC致死性高，中国占全球新发与死亡病例40%以上，晚期或复发患者治疗手段不理想。本研究证实NSUN4在HCC中显著上调并与不良预后相关，下调NSUN4可损害HCC细胞增殖、迁移、侵袭及体内肿瘤生长；机制上NSUN4高表达增加JAK1 mRNA的m⁵C修饰从而增强其稳定性。转录后RNA修饰广泛参与肿瘤发生与进展，m⁵C动态调控多种生物学功能，多种m⁵C调控因子在HCC发病与进展中起关键作用；既往报道NSUN4在HCC中表达升高且与不良预后相关，本研究在20对组织中于转录与翻译水平予以印证，并阐明其在体内外恶性表型中的作用。NSUN4最初被鉴定为线粒体rRNA甲基转移酶，可甲基化线粒体小亚基12S rRNA；近期研究显示NSUN4可结合3'UTR调控Sox9的m⁵C甲基化与翻译重编程。本研究通过生物信息学预测JAK1为NSUN4靶基因，JAK1是JAK-STAT通路关键因子，在包括HCC的多种肿瘤中为重要致癌通路；既往报道HCC中JAK1 mRNA显著上调，JAK1抑制剂可抑制HepG2与Huh-7细胞生长。本研究证实NSUN4催化JAK1的m⁵C修饰并调控其表达、促进HCC进展，功能回复实验阐明了NSUN4介导JAK1 mRNA m⁵C修饰与HCC发展间的联系，并显示HCC细胞中JAK1-STAT3通路被激活而沉默NSUN4使其失活。凋亡表型可由JAK1-STAT3生存轴解释：JAK1磷酸化STAT3，活化STAT3维持促生存转录程序（MCL1、BCL-xL、survivin、MYC）并抑制促凋亡FAS，从而提高凋亡阈值；STAT3组成性激活也是HCC抗凋亡表型的已知决定因素。研究提示NSUN4介导的JAK1 m⁵C稳定化维持p-STAT3及该生存程序，NSUN4缺失削弱STAT3依赖的生存信号使平衡趋向凋亡，恢复JAK1则重新激活STAT3并减少凋亡，支持该凋亡表型依赖JAK1；后续应检测BCL-2家族成员、caspase剪切及线粒体功能以验证该模型。结论部分译为：本研究阐明NSUN4通过以m⁵C依赖方式增强JAK1 mRNA稳定化与表达促进HCC进展的潜在机制，为NSUN4介导的m⁵C修饰在HCC中的致癌作用提供机制见解，凸显NSUN4作为HCC治疗有前景靶点的重要意义。