电子束交联水凝胶作为可重现的局部阿霉素递送平台：辐照稳定性、后加载及体外评价

《Gels》：Electron-Beam Crosslinked Hydrogels as Reproducible Platforms for Localized Doxorubicin Delivery: Irradiation Stability, Post-Loading, and In Vitro Evaluation

　　

本研究验证了一种由胶原/CMCNa/PVP/PEO组成的多组分水凝胶，该水凝胶通过25 kGy电子束交联制备，用于阿霉素（DOX）的局部递送。研究人员考察了制备重现性、药物稳定性、加载效率及初步体外生物活性。在三批独立制备的样品中证明了批次间重现性。三批独立制备样品显示出可重现的凝胶分数（90.4–94.0%）、平衡溶胀率（pH 6.4时为1550–1950%，pH 7.4时为1600–1850%）以及以弹性为主的行为（tg δ = 0.014–0.03）。长期降解测试证实了结构完整性，在生理条件下84天后质量损失仅为8.24%。LC-MS分析揭示辐照后DOX发生显著降解，支持采用基于扩散的后加载策略。通过DOX扩散加载的水凝胶表现出高加载效率（>72%）和约3.88 μg/g的加载容量。在体外，水凝胶提供了双相但持续的、扩散控制的DOX释放（58小时内60–68%，呈pH依赖性）。生物测定显示游离DOX对A375黑色素瘤细胞具有浓度依赖性细胞毒性（IC50 = 0.038 μg/mL），而直接辐照的载DOX水凝胶（H-DOX）在低暴露浓度下对VERO上皮细胞和CCD-1070Sk成纤维细胞表现出细胞相容性，并对A375细胞表现出适度的、时间依赖的抗增殖效应。总体而言，这些结果确立了交联水凝胶结合后加载策略作为一种可重现、稳定且具细胞相容性的局部DOX递送平台，突显了其作为黑色素瘤辅助治疗的潜力。

**研究背景与问题**

皮肤完整性对人体健康至关重要，尽管皮肤可自我修复浅表损伤，但在包括皮肤黑色素瘤等恶性肿瘤在内的严重病理状态下，其再生能力往往不足。皮肤黑色素瘤是侵袭性最强的皮肤癌之一，占皮肤癌相关死亡率的比例过高，且全球发病率持续上升。尽管手术仍是主要治疗手段，放疗、靶向治疗和免疫治疗也已整合应用，但肿瘤部位及术后区域的有效局部控制仍是临床难题。这一持续存在的需求推动了局部药物递送系统的开发，旨在维持靶部位治疗药物浓度的同时限制全身暴露。在局部递送平台中，水凝胶因具有水合三维聚合物网络，可设计为在给药部位滞留抗肿瘤药物并提供持续、可控释放，同时维持良好的组织相容性，因而被广泛研究作为药物储库。阿霉素盐酸盐（DOX）是一种广泛使用的广谱蒽环类药物，但其临床应用受到剂量限制性毒性（尤其是心脏毒性）以及难以在不损伤健康组织的情况下在肿瘤部位实现足够药物蓄积的严重制约。全身给药时，仅一小部分注射剂量到达肿瘤，其余分布于健康器官，从而增加毒性并降低整体疗效。尽管基于天然、杂合及刺激响应系统的载DOX水凝胶设计已取得广泛进展，但其临床转化仍受制造挑战制约，尤其是严格的灭菌要求和批次间均一性。交联密度和网络网孔尺寸的微小变化可导致溶胀、扩散和药物释放动力学的显著差异，使重现性成为水凝胶药物递送系统的关键质量属性。从制造和转化角度看，交联策略是决定水凝胶安全性、重现性和药物递送性能的关键因素。电离辐射加工（电子束或伽马辐照）提供了一种"清洁"的交联途径，因为网络形成无需添加化学引发剂或交联剂，同时通过调节吸收剂量和剂量率等参数可在单一可控步骤中实现交联和灭菌。研究人员此前的工作已建立了在灭菌剂量下制备的电子束交联多组分胶原基水凝胶的合成、理化表征和体外生物相容性。基于这些考虑，本研究考察了通过电子束辐照制备的多组分胶原/CMCNa/PVP/PEO水凝胶作为可重现的局部阿霉素递送平台，旨在：(i) 评估批次间重现性（三批以一周间隔独立制备的样品），结合溶胀、凝胶分数、水凝胶密度测量和动态流变学；(ii) 评估蒽环类药物的辐射稳定性（通过综合LC-MS研究DOX在25 kGy电子束辐照水介质中的八种不同辐射分解途径，确立了一项重要的技术边界，即抑制原位辐照并需要分离加载方案）；(iii) 验证后加载和持续释放（建立可重现的被动扩散加载方案，加载效率>72%，并结合生理条件（pH 7.4）和模拟肿瘤微环境（pH 6.4）下58小时的释放测试）；(iv) 靶向体外抗癌功效与非恶性细胞相容性（比较生物学验证证明后加载水凝胶（H-DOX diff.）使A375黑色素瘤代谢活力降低83.7%，同时保持健康上皮（VERO）和真皮成纤维细胞（CCD-1070Sk）的活力）。通过整合制造相关、分析和生物学终点，本研究旨在勾勒即用型局部水凝胶药物递送平台的关键质量属性。

**关键技术方法**

研究人员通过电子束辐照（25 kGy，6 MeV直线电子加速器，平均剂量率4 kGy·min?1）制备胶原/CMCNa/PVP/PEO多组分水凝胶，采用重量法测定凝胶分数、溶胀率和降解行为；利用动态振荡流变学（频率扫描）结合橡胶弹性理论计算交联间平均分子量（M_C）、交联密度（V_e）和网孔尺寸（ξ）；通过FTIR（ATR模式）评估化学完整性；采用LC-MS（Q-ToF，正负ESI模式）分析DOX辐射降解产物；通过HPLC-FLD定量DOX加载和释放；使用垂直Franz扩散池进行体外释放测试；采用CCK-8、LIVE/DEAD和荧光免疫标记进行体外生物评价。细胞系A375、VERO和CCD-1070Sk购自ATCC。

**研究结果**

**2.1 辐射交联水凝胶的结构与理化表征**

三批独立制备水凝胶的凝胶分数为90.4%–94.0%（相对标准误差约1%），证实了跨制备批次高度一致的交联度。载DOX水凝胶（H-DOX）凝胶分数略低（87.9%），可能与辐照期间药物存在影响自由基介导的交联反应有关。三批水凝胶在23 °C超纯水中的溶胀密度均约为0.998 g·cm?3（相对标准误差<0.22%），进一步印证了结构均一性和制备重现性。在pH 6.4、7.4和超纯水中，水凝胶均表现出时间依赖性溶胀增加，24–48 h内达到平衡，超纯水中平衡溶胀度最高（约4700–5300%），属超吸收材料；缓冲介质中溶胀度显著较低（pH 6.4约1550–1950%，pH 7.4约1600–1850%），反映了溶解盐的离子屏蔽效应。pH 6.4时溶胀度略高于pH 7.4，可能归因于弱酸性条件下可电离官能团（如CMCNa的羧甲基）的部分质子化。所有溶胀介质中批次间相对偏差<1%。在PBS（pH 7.4，37 °C）中84天的体外降解测试显示，前21天无可测量质量损失，49天累计质量损失<4%，84天达8.24±0.08%，表明形成了密集的永久交联网络，对水解裂解具有高度抵抗力。

**2.2 流变学和FTIR结构分析**

非辐照前驱水凝胶在频率高于3.5–5 Hz时表现液体样行为，DOX的存在未显著影响粘弹性性质。经电子束辐照后，系统发生巨大流变学变化，形成弹性主导网络，储能模量几乎与频率无关且远高于损耗模量，损耗正切极低（0.014C）为11.84±0.20 kg/mol，交联密度（V_e）为85.17±1.48 mol/m3，网孔尺寸（ξ）为18.57±0.33 nm；DOX掺入后M_C降至8.95±0.18 kg/mol，V_e升至112.03±1.65 mol/m3，ξ降至16.99±0.02 nm，反映形成更紧凑、更具弹性的网络结构，可能归因于DOX与聚合物官能团间的氢键或静电相互作用作为二级交联点。FTIR分析表明，25 kGy辐照后未观察到显著谱带位移、消失或新吸收特征，表明电子束加工未诱导可检测的化学降解；H-DOX中DOX的掺入未引起新吸收带或显著峰位移，表明DOX以物理包埋方式而非化学接枝进入网络。

**2.3 电子束辐照后阿霉素的稳定性**

综合LC-MS分析揭示，DOX水溶液经电子束辐照后形成至少八种不同降解产物，包括羟基化衍生物和缺失四氢吡喃环的化合物。鉴定出的降解产物包括D561（水合加成产物）、D559abc异构体（羟基化形式）、D398ab和D412ab（缺失四氢吡喃环）、D529（丢失碳原子）。这些化学改变可能损害DOX的治疗功效。因此，为保持DOX的结构完整性和生物活性，研究人员采用辐照后加载策略，即在电子束交联步骤后通过扩散将DOX引入水凝胶基质。

**2.4 生理pH和模拟肿瘤微环境中DOX的体外释放评价**

三批水凝胶在三次独立加载实验中表现出一致的DOX加载量（平均约1130–1155 ng，相对标准误差1.3%–1.9%），总体相对标准误差仅0.87%。加载效率一般介于68.8%–76.5%，平均约72%，对于被动扩散驱动的后加载方法而言高度稳健。三批的载药量（相对于干水凝胶质量）分别为3.90、3.83和3.92 μg/g，平均3.88 μg/g。在pH 6.4和pH 7.4条件下，水凝胶均表现出双相释放模式：初始快速释放相（前0.5–5 h）释放约25–30%，随后进入平台期，表明扩散控制的运输。pH 6.4时58小时累积释放约60–63%，pH 7.4时略高（约65–68%）。该差异归因于pH依赖的聚合物电荷密度和溶胀特性变化，而非药物电离状态的显著改变（DOX在两种pH下均主要保持阳离子状态，pKa=8.3）。

**2.5 体外生物学性能**

**2.5.1 游离DOX对A375黑色素瘤细胞的细胞毒性潜力**

A375细胞在24 h和72 h均表现出DOX浓度依赖性的活力下降，72 h效应更显著。非线性回归分析（四参数可变斜率模型）得出IC50为0.038 μg/mL（95%置信区间：0.024–0.049 μg/mL；R2=0.9878）。基于此估计，选择0.01–0.04 μg/mL浓度范围用于后续实验。形态学观察与活力结果一致，0.09–1.56 μg/mL DOX处理的细胞表现出形态改变，而0.01–0.04 μg/mL处理的细胞保持典型A375形态。

**2.5.2 载DOX水凝胶对VERO和CCD-1070Sk细胞系的细胞毒性效应**

LIVE/DEAD荧光显微图显示所有提取介质中均以绿色染色活细胞为主。CCK-8定量评估显示，72 h时游离DOX和H-DOX提取物均呈现DOX浓度越低增殖率越高的趋势。CCD-1070Sk成纤维细胞对DOX表现出更高敏感性，72 h后代谢活跃活细胞数较阴性对照下降2倍。

**2.5.3 载药水凝胶对A375黑色素瘤细胞的细胞毒性和抗增殖效应**

荧光图像显示以绿色染色活细胞为主，无明显红色荧光死细胞。扩散加载水凝胶提取物（H-DOX diff.）在24 h和72 h均可见细胞密度降低。CCK-8显示H-DOX diff.在24 h使A375细胞代谢活性降低46.2%，72 h后降低83.7%。H-DOX组代谢活性略高于HYD组（p<0.01），但仍较TCPS对照低约30%，表明0.1 μg/mL浓度下DOX的抗增殖效应因药物降解而受限。理论介质浓度计算表明，H-DOX释放的DOX在24 h和72 h的C_medium仅约0.026和0.029 μg/mL，低于游离DOX的IC50值（0.038 μg/mL），加之辐射分解产物的存在，直接解释了原位辐照H-DOX提取物有限的抗增殖效应。相反，H-DOX diff.的C_medium在24 h约0.36 μg/mL、72 h约0.40 μg/mL，安全超过IC50阈值，充分解释了72 h后83.7%的A375黑色素瘤代谢活性抑制。补充材料进一步证实，25 kGy辐照的游离DOX较未辐照DOX对A375细胞的抗增殖活性减弱， corroborating that in situ radiation crosslinking inactivates the therapeutic payload。

**讨论与结论**

本研究证明25 kGy电子束辐照能够稳健且可重现地制备多组分胶原/CMCNa/PVP/PEO水凝胶，为局部阿霉素递送提供结构稳定且功能性的平台。三批独立制备样品的批次间重现性得到确认，关键参数变异极小。水凝胶表现出优异的长期稳定性，证实了密集交联网络的存在。综合LC-MS分析表明，DOX水溶液直接电子束辐照（25 kGy）通过多种裂解途径诱导辐射分解降解，产生苷元异构体和缺失关键四氢吡喃环的衍生物。因此，载DOX预水凝胶直接辐照（H-DOX）因载荷降解和亚阈值活性药物分配而对A375黑色素瘤细胞表现出减弱的抗增殖反应。为避免辐射诱导的药物失活同时充分保留25 kGy同步辐射交联和终端灭菌的优势，研究人员成功实施了基于扩散的后加载方法（H-DOX diff.）。该方法表现出高重现性（相对标准误差<1%）、加载效率超过72%、平均加载容量约3.88 μg/g干聚合物基质。水凝胶在生理条件（pH 7.4，约65–68%）和模拟肿瘤微环境（pH 6.4，约60–63%）下均提供58小时的双相、持续、扩散控制的DOX释放。体外生物学评估表明，未包封DOX以浓度依赖性方式抑制A375人黑色素瘤细胞增殖，72 h的IC50为0.038 μg/mL。原位辐照H-DOX配方表现出有限的抗增殖活性，而制备后扩散加载的水凝胶平台（H-DOX diff.）表现出显著的抗癌活性，72 h处理后使A375细胞代谢活性降低83.7%。同时，使用健康VERO上皮细胞和CCD-1070Sk真皮成纤维细胞的间接接触试验表明，直接辐照H-DOX样品的提取物能够支持细胞存活，但测试条件间存在统计学显著差异；然而，这些结果不能直接外推至扩散加载配方，其对非恶性细胞的细胞相容性仍有待建立。总体而言，这些发现确立了电子束辐射交联多组分水凝胶结合制备后扩散加载在保持DOX抗增殖活性方面的有效性，突显了该平台用于局部药物递送的潜力。尽管如此，仍需进一步评估扩散加载配方的细胞相容性和选择性，以验证其作为黑色素瘤手术切除后辅助治疗的适用性。