《Cells》：Effects of Different Concentrations of Platelet-Rich Plasma-Derived Extracellular Vesicles on Cellular Activity and Lineage-Associated Marker Expression in Tendon Stem Cells
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背景：肌腱干细胞（TSCs）凭借其自我更新能力和多向分化潜能参与肌腱的维持与修复。富血小板血浆源细胞外囊泡（PRP-EVs）可能调控组织修复；然而，其对TSCs细胞活性及谱系相关标志物表达的影响尚不明确。目的：探究不同浓度PRP-EVs对TSCs中CCK-8信
背景：肌腱干细胞（TSCs）凭借其自我更新能力和多向分化潜能参与肌腱的维持与修复。富血小板血浆源细胞外囊泡（PRP-EVs）可能调控组织修复；然而，其对TSCs细胞活性及谱系相关标志物表达的影响尚不明确。目的：探究不同浓度PRP-EVs对TSCs中CCK-8信号以及肌腱相关和替代谱系相关标志物表达的影响。方法：通过酶消化法从大鼠跟腱组织中分离TSCs，并使用流式细胞术、免疫荧光染色、集落形成实验和多向分化实验进行鉴定。通过差速超速离心法从合并的大鼠PRP中分离PRP-EVs，并使用透射电子显微镜（TEM）、动态光散射（DLS）和蛋白质印迹法进行表征。研究人员分别以0、5、20和40 μg/mL浓度的PRP-EVs处理TSCs。将CCK-8吸光度作为细胞代谢活性的指标。采用实时定量PCR和蛋白质印迹法分别评估肌腱相关标志物（ScxA、Col I和Tnmd）以及替代谱系相关标志物（Osx、RUNX2、SOX9和PPARγ）的mRNA和蛋白表达水平。结果：TEM显示PRP-EV制备物中存在囊泡样结构，DLS测得其平均粒径为198.6 ± 94.5 nm。蛋白质印迹法检测到EV相关蛋白TSG101、CD9和CD81。PRP-EV处理增加了CCK-8信号，在所测试的浓度中，40 μg/mL通常产生最强的总体响应，尽管各浓度之间的差异并非始终显著。该处理还与肌腱相关标志物表达的增加以及替代谱系相关标志物表达的普遍降低相关。结论：PRP-EV处理增加了体外培养的大鼠TSCs中的CCK-8信号，并改变了肌腱相关和替代谱系相关标志物的表达。这些发现表明PRP-EVs在体外调节TSCs的分子表型。
研究背景与科学问题
肌腱损伤，尤其是慢性肌腱病，是常见的肌肉骨骼疾病，会严重影响身体功能、活动能力和生活质量。肌腱作为连接肌肉与骨骼的特化结缔组织，其固有的愈合能力有限，这与其较低的细胞密度和有限的血管分布有关。肌腱愈合过程常伴随长时间的組織重塑、紊乱的细胞外基质沉积以及力学性能较差的瘢痕组织形成，难以恢复正常的结构和功能。当前的临床管理策略，包括药物治疗、物理治疗和康复训练，虽能在一定程度上缓解症状，但在实现满意的结构和功能恢复方面仍面临挑战，尤其是在慢性肌腱病中。这些局限性促使研究者们日益关注能够改善肌腱修复质量和支持组织再生的生物学方法。
肌腱干细胞（TSCs），也称为肌腱干/祖细胞（TSPCs），是存在于肌腱组织中的一种成体干/祖细胞群体，因其在肌腱维持和修复中的潜在作用而备受关注。TSCs具备干细胞的特性，如克隆形成能力和多向分化潜能。然而，在病理或不适宜的微环境条件下，TSCs也可能发生成骨、成软骨或成脂分化，这可能促进异常的組織重塑并损害肌腱稳态。因此，寻找既能支持TSCs活性、又能促使其维持肌腱相关分子表型并限制其向非肌腱谱系分化的策略，对于改善肌腱修复具有重要意义。
富血小板血浆（PRP）作为一种生物疗法，因其富含高浓度的血小板和复杂的生物活性成分而被广泛研究。然而，PRP的成分复杂，其临床效果存在异质性。细胞外囊泡（EVs）是介导细胞间通讯的膜结合颗粒。PRP衍生的EV（PRP-EV）制备物作为一种潜在的无细胞组织修复方法引起了越来越多的兴趣。已有研究表明PRP-EVs对肌腱-骨愈合和肌腱修复有益，并可减轻应激相关的TSPCs衰老、保护其增殖和肌腱相关标志物表达。尽管如此，现有研究大多聚焦于增殖、迁移或成肌腱分化，而PRP-EVs对TSCs更广泛的分化谱系的影响，特别是是否能同时促进肌腱相关表型并抑制成骨、成软骨和成脂谱系表型，以及这些效应是否随PRP-EVs浓度变化，尚未被系统评估。因此，本研究旨在探讨不同浓度PRP-EVs对大鼠TSCs体外生物学行为的影响。
研究方法概述
研究人员首先从3只健康雄性Sprague-Dawley大鼠的跟腱组织中，通过酶消化法分离并培养TSCs，随后将其合并为一个混合细胞制剂。同时，从另外10只大鼠的右心室采血，通过两步离心法制备PRP，再通过差速超速离心法从PRP中分离PRP-EVs，并将所有个体的PRP-EV制备物合并成一个混合制剂。研究使用了多种关键技术方法：流式细胞术和免疫荧光染色用于鉴定TSCs的表面标志物和细胞内标志物；集落形成实验评估其克隆形成能力；多向诱导分化实验验证其成骨、成软骨和成脂分化潜能；透射电子显微镜（TEM）观察PRP-EVs的超微结构；动态光散射（DLS）测量其粒径分布；蛋白质印迹法（Western blotting）检测EVs的标志蛋白。在干预实验中，使用不同浓度（0、5、20、40 μg/mL）的PRP-EVs处理TSCs，并通过CCK-8法评估细胞代谢活性，利用实时定量PCR（qPCR）和蛋白质印迹法分别在mRNA和蛋白水平检测肌腱相关标志物（ScxA、Col I、Tnmd）和替代谱系相关标志物（Osx、RUNX2、SOX9、PPARγ）的表达。
研究结果
3.1 TSCs形态学观察
通过酶消化法从大鼠跟腱组织分离的细胞，在体外培养中呈现铺路石样形态，细胞密度随时间逐渐增加，并在传代后保持一致的形态。
3.2 TSCs表型鉴定
流式细胞术结果显示，TSCs表面间充质干细胞相关标志物CD44和CD90的阳性率分别为89.4%和100%。免疫荧光染色未检测到CD34的表达，但呈阳性表达干细胞相关标志物核干细胞因子（NS）、SSEA-4和Oct-3，以及肌腱相关标志物ScxA、Tnmd和Col I。
3.3 TSCs集落形成能力
TSCs在体外培养中形成了可见的集落，证实了其具有克隆形成能力。
3.4 TSCs多向分化潜能鉴定
通过成骨（茜素红染色阳性）、成软骨（阿利新蓝染色阳性）和成脂（油红O染色阳性）诱导分化实验，证实了所分离的TSCs具备多向分化潜能。
3.5 PRP表征
PRP制备成功，各样本的血小板浓度均超过1600 × 109/L，血小板富集倍数约为4至5倍。
3.6 PRP-EVs表征
TEM观察到PRP-EVs呈现近似圆形或椭圆形的囊泡结构，由双层脂质膜包裹。DLS测定其平均粒径为198.6 ± 94.5 nm。蛋白质印迹法检测到EV相关蛋白TSG101、CD9和CD81的表达。
3.7 PRP-EVs对TSCs中CCK-8信号的影响
双因素重复测量方差分析显示，处理组和时间的主效应以及两者的交互效应均显著。简单效应分析表明，在20和40 μg/mL组中，CCK-8信号随时间显著增强，尤其在40 μg/mL组中，信号从第1天到第3天再到第5天持续显著升高。在各时间点，20和40 μg/mL组的CCK-8信号通常显著高于对照组，其中40 μg/mL组在多个时间点的信号显著高于其他处理组。这表明PRP-EV处理与CCK-8信号的增加相关，且40 μg/mL浓度下反应最强。
3.8 PRP-EVs对TSCs中谱系相关标志物表达的影响
3.8.1 对mRNA表达的影响
与对照组相比，所有PRP-EV处理组中肌腱相关标志物（ScxA、Col1a1、Tnmd）的mRNA表达水平均升高，其中20和40 μg/mL组达到统计学显著性。相反，所有PRP-EV处理组成骨标志物（Osx、RUNX2）、软骨标志物（SOX9）和脂肪标志物（PPARγ）的mRNA表达水平均显著降低。40 μg/mL组在某些标志物上的抑制效应比20 μg/mL组更强。
3.8.2 对蛋白表达的影响
蛋白质印迹结果与mRNA趋势基本一致。在蛋白水平，20和40 μg/mL PRP-EV处理显著上调了肌腱相关标志物（ScxA、Col I、Tnmd）的表达，并显著下调了成骨标志物（Osx、RUNX2）、软骨标志物（SOX9）和脂肪标志物（PPARγ）的表达。总体上，40 μg/mL组表现出最强的调节效应，尤其是在抑制替代谱系标志物方面，如RUNX2、SOX9和PPARγ的蛋白表达在40 μg/mL组显著低于20 μg/mL组。
讨论与结论总结
讨论部分指出，本研究所分离的细胞在表型和功能上符合TSCs的特征，为后续干预实验提供了合适的体外模型。PRP-EVs的表征结果也支持其在制备物中得到富集。研究发现PRP-EVs能增加TSCs的CCK-8信号，这与既往关于血小板衍生EVs促进肌腱祖细胞增殖活性的报道相符，且这种效应存在浓度依赖性。此外，PRP-EVs处理上调了肌腱相关标志物的表达，这表明其可能调节TSCs内源性肌腱相关分子程序。更重要的是，PRP-EVs处理同时下调了成骨、成软骨和成脂等替代谱系相关标志物的表达，提示PRP-EVs可能有助于维持TSCs的肌腱相关分子表型，抑制其向非肌腱方向分化，这对于预防病理性組織重塑至关重要。研究人员也指出了研究的局限性，包括体外模型的局限性、EV表征不够全面（如未评估粒子浓度和阴性标志物）、剂量设置范围有限、缺乏直接的增殖和功能性分化检测，以及机制探索不足等。
研究结论：PRP-EV处理增加了体外培养的大鼠TSCs中的CCK-8信号，并改变了肌腱相关和替代谱系相关标志物的表达。具体而言，肌腱相关标志物（ScxA、Tnmd和Col I）普遍上调，而成骨（Osx和RUNX2）、成软骨（SOX9）和成脂（PPARγ）标志物普遍下调。在所测试的浓度中，40 μg/mL产生了最显著的总体效应，尽管各浓度间的差异并非始终一致。这些发现表明PRP-EVs在体外调节TSCs的分子表型；其对功能性分化和肌腱修复的影响仍有待确定。
