脯氨酸/小米多酚提取物基于秀丽隐杆线虫模型的抗氧化活性及其转录组与代谢组机制研究

《Foods》：Development of Pullulan-Based Colorimetric Film with Butterfly Pea for Shrimp Freshness Monitoring

　　

小米多酚类物质富含营养成分，具有抗氧化、抗菌及降血糖活性，但其体内作用机制尚不明确。本研究采用三元天然低共熔溶剂（NADES）作为传统溶剂的绿色替代方案，结合超声辅助提取对纯化小米多酚提取物进行优化。以秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）作为体内模型评估抗氧化活性，测定其生长发育、运动能力、寿命及抗氧化酶活性，并结合转录组RNA-seq、RT-qPCR及非靶向代谢组学探究潜在调控机制。结果表明，纯化小米多酚提取物可改善应激状态下线虫的生长发育和运动能力，并延长其寿命；可提高超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化氢酶（CAT）活性，降低丙二醛（MDA）水平。转录组与代谢组结果提示，纯化谷子多酚提取物的抗氧化效应可能与Wnt、PI3K-Akt及P53/P21信号通路的改变有关；同时，代谢物水平重塑（如甘油磷脂代谢和嘌呤代谢）也提示其可能通过多通路网络发挥保护作用。然而，这些通路是否被激活并因果性参与保护效应仍需功能实验验证。

研究背景方面，许多疾病的发生与人体内氧自由基相关，氧自由基可攻击神经细胞线粒体造成细胞损伤，从而引发神经系统疾病；羟自由基反应活性高于其他自由基，易与其他分子反应导致DNA分子损伤。多酚中的酚羟基可打断氢原子与自由基的结合从而清除自由基，葡萄籽多酚、绿茶多酚和石榴多酚等食用植物天然多酚提取物的抗氧化潜力已被大量研究阐明。小米是中国种植历史最悠久的谷类作物之一，富含膳食纤维、蛋白质、淀粉和维生素等，且富含游离态和结合态酚酸（如羟基苯甲酸、羟基肉桂酸等），还含有黄酮、黄烷醇和异黄酮，部分小米还含有少量单宁。多酚化合物具有健康促进作用，在预防或减少骨质疏松、癌症、糖尿病、神经及心血管等退行性疾病方面发挥重要作用，因此有必要深入挖掘和利用小米资源。小米多酚作为一种新型天然活性物质已成为植物化学领域的研究热点，在医药领域也展现出良好的开发潜力。秀丽隐杆线虫生长周期短，20 °C下可存活2–3周，实验室易于培养，可大幅缩短实验周期并便于实验设计和重复操作；虫体透明、结构简单，显微镜下可观察其生存状态、外观特征和内部结构；在所有模式生物中，秀丽隐杆线虫是首个完成全基因组测序的物种，其完整基因组序列可用，约50%的人类蛋白编码序列在线虫中具有可识别的同源基因。已有研究成功鉴定出多种抗衰老化合物并在线虫中阐明其作用机制，如芦丁可激活线虫热休克蛋白、促进daf-16表达、增强抗氧化应激能力并延长生存时间；口服黑茶可显著降低活性氧水平并在H2O2诱导的氧化应激中表现出更长的寿命；柑橘皮和黄檀的类黄酮提取物可缓解线虫氧化应激损伤，在神经退行性疾病中具有良好应用前景。为填补小米多酚抗氧化活性相关知识的空白，本研究以小米为原料，采用研究组已建立的方法制备多酚、分离活性成分并测定其基本理化性质，建立线虫氧化应激模型，系统分析纯化小米多酚提取物对线虫生理指标、转录组和代谢组的影响。研究结果为纯化小米多酚提取物及谷物多酚的深加工技术研究和产品开发创新提供重要参考，也为抗氧化天然活性成分的寻找和产品开发提供重要参考。

研究人员开展的研究如下：首先筛选九种三元天然低共熔溶剂（NADES-1至NADES-9），以多酚提取率为评价指标，发现NADES-2（甘油/苹果酸/葡萄糖，摩尔比1:1:1）提取效率最高，故选为提取溶剂；在此基础上进一步优化提取参数，包括摩尔比（1:2:1、2:1:1、3:2:1、4:2:1、5:2:1）、含水量（20%–70%）、液固比（20–60 mL/g）、超声时间（20–60 min）和提取温度（30–70 °C）。最优工艺为：称取0.1 g脱脂小米粉，加入2 mL含水量30%的NADES-2（甘油/苹果酸/葡萄糖摩尔比3:2:1），混匀后置超声清洗器中于63 °C超声提取39 min，提取后8000 rpm离心15 min，在此条件下小米多酚提取量可达8.23 mg/g。小米多酚粗提物湿法上柱，蒸馏水除杂使多酚吸附于大孔树脂，以70%乙醇解吸，收集纯化多酚、蒸发浓缩、经0.45 μm滤膜过滤并冻干成粉，纯化后多酚纯度为73.8% ± 0.62%；多酚浓度为14 mg/mL时，DPPH和ABTS·自由基清除率分别为52.25%和64.48%。研究组前期采用化学鉴定、红外光谱、紫外-可见光谱和液相色谱-质谱分析纯化小米多酚成分，推测其含有黄酮类物质，主要为羟基咖啡酸、氯化矢车菊素-3-O-半乳糖苷和对香豆酰苹果酸。线虫培养以尿嘧啶缺陷型大肠杆菌OP50为食，实验分为正常组、模型组和多酚组（100、200和400 μg/mL）。生理特性测定方面，取培养5天的线虫置于无食物空NGM板，体视显微镜下拍照，用ImageJ软件（版本1.54r）测量体长和体宽，并记录1 min内身体弯曲和头部摆动次数以评价运动能力；寿命实验在含OP50和150 μM 5-氟尿嘧啶（抑制繁殖）的NGM板上进行，对照组正常培养，模型组以1000 μM H2O2诱导氧化应激，多酚组给予相同浓度H2O2并补充相应浓度纯化小米多酚提取物，每48 h更换新鲜处理板，自转移当日起每日监测线虫存活情况并记录存活数和存活天数，排除爬壁死亡或意外死亡个体，每组设三个平行板、每板约30条线虫。氧化应激相关酶/非酶水平测定方面，同步化L4期线虫经不同剂量提取物处理并设未处理对照，多酚处理5天后转移至含1000 μM H2O2的培养基氧化应激暴露48 h，收集线虫用M9缓冲液洗涤3–5次、离心弃上清，沉淀加预冷生理盐水组织研磨匀浆后离心收集上清，先用BCA试剂盒测定总蛋白浓度，再按SOD、CAT和MDA试剂盒说明书测定特定波长吸光度并计算各指标。氧化应激耐受试验中，同步化线虫经多酚预处理5天后转移至含0.1% H2O2的急性应激培养基，逐小时观察并记录存活情况，各处理组使用5个重复板、每板30条线虫。线虫氧化应激模型的建立仅在预实验中进行以确定建模的最佳H2O2浓度，同步化L4期线虫暴露于含不同浓度H2O2的NGM培养基48 h，取出成虫用缓冲液洗涤三次并破碎测定MDA水平，若MDA含量显著升高则模型建立成功。转录组分析方面，将L4期同步化线虫随机分为对照组、模型组和多酚处理组（MD），对照组和模型组在标准NGM板培养，MD组在含最佳浓度纯化小米多酚提取物的NGM板上连续培养5天，之后模型组和MD组同时转移至含1000 μM H2O2的NGM培养基氧化应激暴露48 h后采集样本，对照组在相应时间点作为空白对照采集，用缓冲液洗涤3–5次、离心、液氮冷冻后转移至?80 °C保存，委托上海美吉生物医药科技有限公司进行转录组测序；提取总RNA并质检，富集片段化mRNA作为模板逆转录合成cDNA，经末端修复、加A尾和接头连接后PCR富集文库片段完成建库并进行高通量测序；原始数据过滤获高质量序列，与参考基因组比对，计算基因表达并进行功能富集和表达模式聚类分析，最后筛选抗氧化相关基因并用实时荧光定量PCR验证，以act-1为内参基因，采用2?ΔΔCt值定量分析。非靶向代谢组学方面，采用基于UHPLC-Q Exactive HF-X的非靶向代谢组学方法分析，样品称重入离心管加研磨珠和400 μL预冷提取液（甲醇:水=4:1，含0.02 mg/mL内标）提取代谢物，所有样品等体积混合制备质控（QC）样本，每分析6个样品插入一个QC样本以检验全过程重复性；LC-MS分析色谱条件为HSS T3柱（100 mm × 2.1 mm，1.8 μm）、柱温40 °C、流速0.40 mL/min、进样量3 μL，流动相A为95%水、5%乙腈和0.1%甲酸，流动相B为47.5%乙腈、47.5%异丙醇、5%水和0.1%甲酸，梯度洗脱；原始数据经软件峰识别、积分、保留时间校正和峰对齐形成数据矩阵，剔除异常值并标准化后进行主成分分析（PCA）和正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA），以7折交叉验证评价模型稳定性，以变量投影重要性（VIP）> 1且Benjamini–Hochberg（BH）校正q < 0.05筛选差异代谢物，因未使用标准品，代谢物以MSI Level 2推定注释报告。统计分析采用GraphPad Prism 9，以单因素或双因素方差分析检验组间显著性（p < 0.05，n = 3），不同字母表示均值差异显著（p < 0.05），寿命分析采用Log-rank（Kaplan–Meier）检验计算平均寿命并评价组间差异，数据以mean ± SD表示。

主要关键技术与方法概括：研究采用三元天然低共熔溶剂（NADES）结合超声辅助提取优化小米多酚提取工艺，经大孔树脂纯化制备纯化小米多酚提取物；以秀丽隐杆线虫（N2）为体内模型，以大肠杆菌OP50为食建立H2O2诱导氧化应激模型；测定体长体宽、运动行为、寿命及SOD、CAT活性和MDA含量等生理生化指标；采用转录组RNA-seq结合RT-qPCR验证及基于UHPLC-Q Exactive HF-X的非靶向代谢组学（PCA、OPLS-DA分析）探究机制；统计采用GraphPad Prism 9方差分析与Log-rank检验。线虫（N2）和大肠杆菌（OP50）购自福建上源生物科学技术有限公司。

研究结果：3.1 多酚对秀丽隐杆线虫体长和体宽的影响——通过测量线虫体长体宽反映生长状态，结果表明模型组体长和体宽显著低于正常组，分别为1161.24 ± 62.09和61.78 ± 3.2，下降9.12%和12.25%；与模型组相比，多酚处理后线虫体长和体宽增加，LD组体长和体宽分别增加7.34%和3.02%，MD组分别增加4.76%和9.3%，HD组分别增加7.0%和8.81%，说明H2O2对线虫体长体宽有抑制作用、加重氧化应激水平、影响细胞结构与功能完整性并进一步抑制生长发育，而多酚可缓解其不良影响。3.2 多酚对秀丽隐杆线虫运动行为的影响——以头部摆动和身体弯曲频率衡量运动能力，结果显示各组头部摆动频率无统计学显著差异（p > 0.05），HD组虽数值上略高于模型组（增加7.59%），提示多酚处理对线虫头部摆动频率影响有限；各组建弯曲频率存在显著差异，与正常组相比模型组身体弯曲频率下降21.91%，与模型组相比LD组增加11.94%、MD组增加18.71%、HD组增加12.9%，初步结果表明纯化小米多酚提取物对H2O2刺激所致线虫运动行为缺陷有一定缓解作用。3.3 多酚对秀丽隐杆线虫寿命的影响——通过存活实验评价，与空白对照组（平均寿命17.54天）相比，模型组生存曲线左移、平均寿命显著缩短至12.5天（Log-rank检验，p = 0.002），表明H2O2暴露诱导明显氧化应激损伤；与模型组相比，不同浓度纯化谷子多酚提取物处理组生存曲线呈一定右移趋势，数值上MD组寿命延长最明显，平均寿命延长至15.80天（增加26.4%）、最大寿命24天，HD组表现相近但略低，平均寿命15.66天（增加25.3%）、最大寿命26天，LD组平均寿命14.47天（增加15.8%）；值得注意的是Log-rank趋势检验未发现显著线性剂量依赖效应（p = 0.5914），提示提取物的延寿效应可能并非简单线性浓度依赖，而是非单调剂量反应；总体提示纯化谷子多酚提取物干预可能有助于缓解H2O2诱导的寿命缩短，MD组在整体指标上表现出相对最佳干预潜力，但其确切剂量效应关系仍需更大样本量进一步验证。3.4 多酚对秀丽隐杆线虫抗氧化应激的分析——线虫喂养5天后转移至含0.1% H2O2培养基观察存活率，生存曲线显示与空白组相比多酚处理组线虫平均寿命分别延长10.86%、18.24%和11.09%，表明多酚具有明显的抗H2O2能力；许多研究表明线虫在氧化应激下存活率越高寿命越长，已有报道黄酮、黄酮类和香豆素等多酚可显著改善氧化应激、炎症和细胞衰老等功能；综上多酚可通过降低线虫氧化应激指标抵抗过氧化氢不利环境，从而提高氧化应激能力并延长生存时间。3.5 多酚对H2O2诱导的秀丽隐杆线虫氧化应激相关酶的影响——SOD和CAT是线虫重要抗氧化酶，可清除过量自由基并延缓衰老，是评价线虫衰老程度的重要指标；MDA是细胞多不饱和脂肪酸过氧化的自由基产物之一，其含量可反映体内自由基水平并间接反映细胞衰老，可作为衰老的重要标志物。H2O2处理后模型组CAT活性显著低于正常组，与模型组相比多酚组CAT活性分别提高70.90%、92.69%和68.78%；模型组SOD活性较对照组提高52.28%，与模型组相比多酚对线虫SOD活性的影响分别提高19.92%、31.15%和5.24%；研究表明具有抗衰老作用的生姜提取物可显著提高线虫SOD活性，因此纯化谷子多酚提取物的抗氧化作用可能与线虫SOD活性显著升高有关；模型组SOD活性升高伴随CAT活性降低可能反映抗氧化防御系统失衡，SOD活性升高可能是对超氧阴离子的代偿反应，而主要负责清除H2O2的CAT在过量H2O2应激下更易氧化失活，SOD与CAT的这种差异反应可能加剧H2O2积累，与模型组MDA水平升高一致；多酚处理后CAT活性明显恢复，提示多酚可能通过减轻CAT氧化损伤帮助维持抗氧化系统平衡。此外与空白组相比模型组MDA含量显著升高，多酚处理可显著降低线虫MDA含量，分别降低9.46%、21.9%和26.53%，表明多酚可抑制H2O2诱导的线虫脂质氧化损伤。3.6 氧化应激模型的建立——以H2O2诱导线虫氧化应激并测定MDA含量，随H2O2浓度升高线虫MDA含量显著增加，且1000 μM H2O2对线虫存活影响较小，故选择1000 μM H2O2建立氧化应激模型。3.7 小米多酚对秀丽隐杆线虫转录组的影响——各多酚处理组干预效果存在差异，HD组在改善运动能力和降低脂质过氧化方面最突出，MD组在抗氧化应激、SOD/CAT活性和延长寿命方面表现最佳；尽管部分酶活性变化在LD组比MD和HD组更明显，但其整体表型改善相对较弱；综合权衡所有生理生化指标，本研究最终选择MD组进行后续转录组和代谢组分析；客观而言，采用单一MD浓度进行组学分析虽可在该条件下提供可靠分子证据，但不能完全表征剂量依赖效应，相关分子特征不应直接外推，该局限仍需未来通过多浓度实验解决。基于上述筛选结果，对氧化应激模型组、多酚干预（MD）组和空白对照组进行转录组测序以探究分子机制；测序数据质量控制显示所有样本RNA的A260/A280 ≥ 1.8，测序质量值Q20 > 98%、Q30 > 95%，碱基分布均衡，表明RNA纯度高、质量好可用于后续分析；各样本TPM密度分布曲线整体轮廓相似；PCA显示氧化应激模型组、多酚干预（MD）组和空白对照组样本各自聚集并相互分离，表明氧化应激下線虫基因谱发生显著变化，火山图亦证实这一点。差异基因分析显示，与空白组相比模型组仅检测到141个差异表达基因（74个上调、67个下调）；与模型组相比MD组有3001个差异基因，其中2282个上调、719个下调，提示多酚干预在转录水平引发广泛级联反应；MD组差异表达基因功能富集显著映射到碳水化合物代谢、氨基酸代谢、蛋白质折叠分类与降解、翻译和信号转导等生物过程，与多酚调控代谢和应激反应的一般认识一致；聚焦应激相关基因，从差异基因中锁定skpo-3、ZK1025.8、tsp-17、F49D11.6、djr-1.2、eya-1、ets-7、pxn-1、C46A5.4和utx-1等多个候选分子，后续讨论聚焦与氧化应激密切相关的eya-1、utx-1、cyp-35A2和tsp-17。EYA是一种高度保守的转录辅因子和蛋白磷酸酶，调控后生动物多个发育过程，eya-1编码蛋白与哺乳动物EYA1-4同源；本研究中MD组eya-1显著下调，提示多酚可能参与凋亡和应激反应调控；Wang等（2014）发现敲低eya-1可导致线虫对高温和氧化应激耐受性显著下降，氧化应激条件下敲低eya-1可使平均寿命缩短18.7%；本研究证实eya-1是线虫抗逆的必需因子，可能作用于daf-16下游调控一系列抗逆基因，因此推测eya-1可能是多酚影响线虫抗氧化应激的潜在靶点，但这仍属假设需进一步验证。Utx-1属于保守组蛋白去甲基化酶家族，特异催化H3K27me3去甲基化，H3K27me3是与染色质抑制相关的标志；MD组utx-1表达显著下调，提示氧化应激所致凋亡信号可能减弱；Jin等（2011）证实敲除或杂合突变utx-1可延长线虫寿命并提高H3K27me3总体水平，确立其为体细胞寿命负调控因子；Maures等（2011）进一步揭示utx-1通过去除胰岛素/IGF-1信号通路（IIS）关键基因daf-2上的H3K27me3抑制标志调控寿命；结合多酚延长氧化应激下线虫寿命的发现，推测utx-1可能是与多酚影响寿命相关的潜在基因之一。cyp-35A2属于CYP35细胞色素P450亚家族，与人CYP2家族高度同源，广泛参与脂肪酸代谢、外源物解毒和氧化应激反应；MD组cyp-35A2显著上调，提示多酚处理可能增强机体对氧化应激的主动防御、提高氧化还原酶活性并有助于减少氧化损伤，该结果与其他多酚转录组研究中观察到的解毒代谢通路上调一致，在其他多酚（如槲皮素和白藜芦醇）的线虫转录组研究中亦观察到类似解毒代谢通路。Tsp-17编码四跨膜蛋白家族成员，参与细胞迁移、黏附、胞内运输和神经保护，该基因在MD组显著下调并参与氧化应激负调控；研究表明glit-1和tsp-17处于同一遗传通路，glit-1和tsp-17突变体均表现出对6-OHDA和百草枯诱导氧化损伤的非加性超敏表型，且氧化应激报告基因被强烈激活；tsp-17下调可能以反馈方式参与线虫氧化损伤调控，其在多酚介导保护效应中的具体贡献仍需进一步探究。总体而言，多酚干预深刻改变了氧化应激下线虫的转录网络，不仅上调以cyp-35A2为代表的解毒防御系统，还下调eya-1、utx-1和tsp-17，这些可能与凋亡调控、表观遗传修饰和应激信号转导相关；将这些转录组线索与长寿表型结合，为下一步靶向多酚缓解氧化应激的功能靶点提供了明确方向。为系统把握多酚干预后转录组的功能趋势，对MD组与模型组差异基因进行GO功能注释，在生物过程、分子功能和细胞组分三个本体中，与氧化应激相关的条目高度富集，生物过程差异表达基因数目最多且显著性最强，其中145个生物过程上调，涉及"生物过程调控"（GO: 1902882）、"对氧化应激的响应"（GO: 0006979）、"生物过程调控"（GO: 0050789）和"对刺激响应的调控"（GO: 0048583）；细胞组分和分子功能分析进一步鉴定大量注释为"抗氧化活性""过氧化物酶活性"和"转移酶活性"的基因，提示多酚的转录响应伴随氧化还原防御网络改变。为验证RNA-Seq实验结果，从差异表达基因中选择5个与应激反应相关的基因进行验证，与模型组相比多酚处理后线虫cyp-35A2、skpo-3和ZK1025.8的mRNA水平显著升高，而eya-1和phat-5表达显著降低，各基因变化趋势与RNA-Seq数据完全一致，证实本研究转录组测序的可靠性。KEGG通路分析进一步揭示多酚的抗氧化效应不依赖单一信号级联，而是同时映射到Wnt、PI3K-Akt、P53/P21、cGMP-PKG、Hippo、mTOR和FoxO等多条通路；其中Wnt信号通路在细胞增殖、分化和凋亡调控中起核心作用，本研究KEGG图中多酚处理后糖原合成酶激酶-3β（GSK-3β）表达上调，GSK-3β是参与蛋白质合成、糖原代谢、有丝分裂和凋亡的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，GSK-3β激活促进β-catenin降解复合物组装从而抑制Wnt/β-catenin信号过度激活；已有报道虎杖苷也通过激活Wnt/β-catenin通路缓解小鼠脊髓损伤氧化损伤，因此多酚的抗氧化作用可能与Wnt信号通路改变有关，但该通路的具体功能贡献仍待实验证实。PI3K-Akt通路也是调控细胞增殖、代谢和凋亡的重要枢纽，本研究构建的通路模型中上游IRS蛋白可增强PI3K活性，将磷脂酰肌醇二磷酸（PIP2）转化为磷脂酰肌醇3,4,5-三磷酸（PIP3），进而招募并激活Akt；一方面活化Akt可磷酸化Caspase-9使其失活从而阻断凋亡级联，另一方面可通过抑制GSK-3活性进一步增强抗凋亡作用；研究表明激活PI3K/Akt通路可减轻氧化应激诱导的细胞损伤，如大蒜素通过该通路减少H2O2诱导的成骨细胞氧化应激并维持线粒体功能；这些发现提示多酚的抗氧化作用可能与PI3K-Akt通路改变有关，但是否通过该通路抑制凋亡仍需功能实验验证。此外本研究差异基因在P53/P21通路显著富集，P53在DNA损伤、过度增殖或炎症刺激下被激活并转录上调P21，P21与Cyclin-CDK复合物结合抑制CyclinD1-CDK4/6和CyclinE-CDK2活性导致细胞周期阻滞；据此推测多酚的抗氧化作用可能与p53/p21信号通路改变有关。KEGG分析还富集到cGMP-PKG、Hippo、mTOR和FoxO信号通路，其中FoxO通路与线虫氧化应激和寿命调控最直接相关；FoxO转录因子在进化上高度保守，参与细胞周期阻滞、凋亡和抗氧化应激等多个过程；在线虫中FoxO同源物DAF-16是胰岛素/IGF-1信号通路下游关键效应因子；本研究发现eya-1作用于DAF-16下游，而utx-1通过去除H3K27me3修饰影响胰岛素/IGF-1信号活性，两基因在多酚处理后均显著改变；同时mTOR通路也出现在富集列表中，其对自噬和蛋白质合成的调控与寿命密切相关；这些结果提示多酚的效应可能不依赖单一通路，而可能与FoxO和mTOR等多个信号网络的改变有关，从而在多个层面将线虫氧化应激反应与寿命调控联系起来。综上，通过转录组测序和实验验证，本研究证实多酚可同时调控cyp-35A2、eya-1、utx-1和tsp-17等关键节点，并系统激活Wnt、PI3K-Akt、P53/P21和FoxO等多条信号通路，从而增强线虫抗氧化应激防御能力；这种多靶点、多通路协同作用模式为分析多酚抗氧化和长寿机制提供了丰富的转录组基础，也为后续功能基因的精准验证指明了方向。3.8 小米多酚对秀丽隐杆线虫代谢的影响——代谢组学数据经7次交叉验证后，质控样本在PCA得分图中紧密聚集且相关性良好，表明检测过程中仪器稳定性高；同一PCA模型下空白组、模型组和MD组之间存在明显分离趋势，表明不同处理条件下线虫代谢物谱发生显著变化。为进一步聚焦组间差异，采用正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）建模，H2O2处理后线虫代谢谱发生改变，表明正常条件下线虫代谢谱在H2O2应激下可显著改变；多酚处理后线虫代谢谱发生改变，表明多酚处理改变了氧化应激下线虫的代谢谱；两个模型Q2均大于0.5，模型的解释力和预测能力满足实验分析要求。从火山图可直观看出候选差异代谢物整体分布，与正常组相比模型组共鉴定出744个候选差异代谢物（393个上调、351个下调）；与模型组相比MD组有716个候选差异代谢物（491个上调、225个下调）；两组候选差异代谢物数量基本处于同一数量级，但MD组上调代谢物比例更高，提示多酚干预可能主动诱导某些保护性代谢通路的激活。对VIP值排名前50的候选差异代谢物进行层次聚类分析，结果表明这些物质主要集中在羧酸及其衍生物、嘌呤核苷、吲哚及其衍生物、甘油磷脂等类别。在转录组结果引导下，以VIP > 1且BH校正q < 0.05为筛选标准，鉴定出MD组与模型组之间一组关键候选差异代谢物；因本研究未进行标准品确认，这些代谢物身份均为MSI Level 2推定鉴定；这些代谢物主要分布在甘油磷脂代谢、嘌呤代谢、ABC转运蛋白和色氨酸代谢等通路，为多酚抗氧化效应在代谢层面提供了潜在关联线索，这些通路的解释在此作为假设提出。MD组甘油磷脂代谢通路共检测到15个候选差异代谢物；甘油磷脂不仅是生物膜的结构基础，其代谢重塑还与能量供应和氧化应激适应密切相关；Cheng等（2016）发现肿瘤细胞中PC和PE等甘油磷脂合成常上调以满足快速增殖的物质和能量需求；Li等（2023）证实核苷酸酵母水解物可通过调控甘油磷脂代谢延长线虫寿命并增强抗氧化能力；多酚干预后甘油磷脂代谢物广泛变化提示多酚可能参与主动调整膜脂组成或信号脂质代谢，从而可能帮助细胞在氧化应激下维持稳态。嘌呤代谢也显著变化，MD组中腺苷、尿酸、黄素和腺嘌呤等13个代谢物含量显著改变；一旦嘌呤补救与从头合成失衡将直接加剧ROS产生；尿酸作为嘌呤代谢终产物在生理浓度下具有强自由基清除能力；近期研究还表明轮钟花提取物通过调控嘌呤代谢发挥线虫抗衰老活性；多酚处理后嘌呤代谢物总体上调提示机体可能增强补救途径或尿酸合成从而提高内源性抗氧化缓冲能力，但这仍需功能实验验证。值得注意的是，MD组中上调的腺苷、纤维二糖、核黄素、黄素、麦芽三糖和硫胺素等代谢物属于ABC转运蛋白的底物或相关分子；ABC转运蛋白家族负责多种内源和外源物质的跨膜转运，在膜脂转运、氧化应激防御和解毒中发挥重要作用，并可通过外排GSH结合物清除毒性化合物；这些底物的协同上调提示多酚可能强化ABC转运蛋白介导的解毒和抗氧化保护网络。色氨酸代谢的多个节点也受多酚调控，MD组中5-甲氧基色胺和L-色氨酸含量增加而吲哚-3-乙酰胺降低；色氨酸代谢广泛参与蛋白质合成、炎症调控和氧化应激反应，其衍生的吲哚类是维持肠道屏障和抗氧化防御的重要分子；多酚调控色氨酸代谢提示其可能在抑制炎症和减少氧化损伤中发挥作用，但因果机制仍不清楚。此外MD组还检测到琥珀酸、喹啉酸和胆绿素等代谢物变化；琥珀酸不仅是三羧酸循环中间产物，还作为信号分子参与氧化应激和炎症调控；胆红素及其还原产物胆绿素是重要内源性抗氧化剂，可直接清除多种ROS、减少顺铂诱导的肾小管细胞凋亡，并通过抑制IL-18和巨噬细胞M1极化缓解炎症；这些代谢物变化提示多酚可能通过能量代谢和抗氧化防御两个维度共同影响线虫氧化还原平衡；这些通路被视为候选机制，仍需功能验证。候选差异代谢物通路富集和拓扑分析列出受影响最大的前20条通路，其中与氧化应激密切相关的主要包括辅因子生物合成、嘌呤代谢、甘油磷脂代谢、氨基酸生物合成、色氨酸代谢、核苷酸代谢、ABC转运和药物代谢-细胞色素P450；这些代谢变化与转录组中观察到的Wnt、PI3K-Akt、FoxO等信号通路响应趋势一致，共同提示多酚可能在转录和代谢两个水平参与调控线虫氧化应激；但这仍属转录组和代谢水平的关联分析，确切因果机制仍需通过基因敲低或突变体研究等实验进一步探究。

讨论部分总结：谷物多酚的抗氧化机制已被广泛报道，但不同谷物主要作用方式可能存在差异，如紫麦多酚组分的作用常与DAF-16/FOXO等转录因子调控相关，而黑米花青素已被证明通过胰岛素/IGF-1信号（IIS）通路发挥抗氧化和延寿作用；与以往多聚焦单一通路的发现不同，本研究发现纯化谷子多酚不仅改善线虫生理指标，其转录组数据还提示Wnt、PI3K-Akt和p53/p21等多条通路的改变；同时代谢组结果中甘油磷脂和嘌呤代谢的波动也与以往红曲和发酵大麦多酚影响脂质和能量代谢的报道一致；这些结果提示谷子多酚的抗氧化效应不仅与谷物多酚共有的基础调控网络（如IIS通路）有关，还伴随更广泛的转录和代谢响应。这种多通路调控和代谢重塑结合本研究采用的绿色提取工艺，提示谷子多酚可能作为高价值天然成分具有潜力，为开发旨在改善氧化还原平衡和代谢稳态的功能食品提供初步科学线索。本研究局限：第一，未设置单独的NADES空白对照或单个NADES组分对照，因此观察到的效应不能完全归因于多酚单体本身；第二，组学分析仅使用整体表型最佳的单一MD浓度，虽可在该条件下提供可靠分子证据，但不能完全表征剂量依赖效应，相关分子特征不应直接外推；第三，关键代谢物未经标准品验证（属MSI Level 2推定鉴定）；最重要的是未进行基因敲低、突变株或通路抑制剂等功能实验，因此富集的Wnt、PI3K-Akt、p53/p21和FoxO等通路仅为提示性候选机制，其激活状态或因果参与尚不能确定；未来工作将纳入适当的NADES空白和组分对照，并针对关键通路采用RNAi敲低或突变实验结合生化验证，进一步阐明多酚的直接分子靶点、关键基因对抗氧化表型的具体贡献以及代谢物变化与生理结局之间的因果关系。研究结论翻译：纯化谷子多酚提取物可改善H2O2应激下线虫的生长发育和运动能力、延长寿命、提高SOD和CAT活性并降低MDA水平；转录组和代谢组结果提示其抗氧化效应可能与Wnt、PI3K-Akt和P53/P21信号通路改变以及甘油磷脂代谢、嘌呤代谢等代谢物水平重塑有关，可能通过多通路网络发挥保护作用；但这些通路是否被激活并因果性参与保护效应仍需功能实验验证。