《International Journal of Molecular Sciences》：Single-Cell RNA Sequencing of Human Lamina Cribrosa Fibroblasts in Glaucoma
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青光眼中人类筛板（lamina cribrosa, LC）细胞外基质（extracellular matrix, ECM）重塑的分子机制迄今仍不清楚。本研究是首个利用单细胞RNA测序（single-cell RNA sequencing, scRNA-seq）
青光眼中人类筛板（lamina cribrosa, LC）细胞外基质（extracellular matrix, ECM）重塑的分子机制迄今仍不清楚。本研究是首个利用单细胞RNA测序（single-cell RNA sequencing, scRNA-seq）表征人类青光眼LC细胞的研究。研究人员旨在表征来源于青光眼眼与正常眼的人类LC细胞的转录变化，并鉴定参与视神经头（optic nerve head, ONH）重塑的信号通路。研究对来自青光眼与正常供体眼的LC细胞进行scRNA-seq分析；差异基因表达分析采用Seurat完成；细胞身份鉴定采用SingleR与GTEx参考数据集评估；通路富集分析采用基因集富集分析（Gene Set Enrichment Analysis, GSEA）进行；转录因子（transcription factor, TF）基序富集采用i-cisTarget评估；验证实验采用定量PCR、蛋白质印迹（Western blotting）、免疫组织化学（immunohistochemistry）和免疫荧光（immunofluorescence）进行。LC细胞经ISRIB与4-PBA处理。利用共享最近邻（shared nearest-neighbour, SNN）聚类与UMAP可视化分析6131个LC细胞，鉴定出四个广泛转录分组并用于后续转录表征；细胞类型图谱分析提示其呈成纤维细胞/间充质细胞来源。青光眼LC成纤维细胞呈现促纤维化转录特征：多种促纤维化基因过表达、参与细胞命运决定的母调控子（master TF regulons）富集，以及包括SRF在内的TF基序，另有关键整合应激反应（integrated stress response, ISR）基因（如ATF4、ATF3与CREB3L1）过表达。富集通路包括E2F、G2M、Hallmark EMT基因集与MYC，而p53通路下调。药理学处理（ISRIB或4-PBA）降低应激反应与ECM基因表达，同时ISRIB减弱了青光眼LC细胞中观察到的细胞代谢活性升高。
研究背景：青光眼是40岁以上人群患病率达2–3%的年龄相关性视神经病变，为该人群不可逆性视力损害的首要原因，以视网膜神经节细胞（retinal ganglion cell, RGC）及其轴突在筛板（lamina cribrosa, LC）水平受损为特征。筛板是视神经头（optic nerve head, ONH）内的筛状结缔组织，为无髓鞘RGC轴突提供结构支撑与营养供应；多数患者伴眼压（intraocular pressure, IOP）升高，但正常眼压性青光眼与眼高压并存，提示眼压并非ONH损伤的唯一驱动因素。青光眼中筛板发生结缔组织压缩、变薄、向巩膜管后移、细胞外基质（extracellular matrix, ECM）过度沉积与重塑而纤维化，并伴TGFβ2升高，但驱动该过程的分子机制尚不清楚。全基因组关联研究（genome wide association study, GWAS）已鉴定300余个独立风险位点，提示ECM组织、胶原生物学与转化生长因子β（transforming growth factor beta, TGFβ）信号为关键机制；既往研究显示LC细胞表达COL1A1、FN1及收缩性肌蛋白α-SMA，但传统群体水平分析无法解析细胞间异质性。本研究是首个利用单细胞RNA测序（single-cell RNA sequencing, scRNA-seq）表征人类青光眼LC细胞的研究。
研究方法：研究采用10× Genomics Chromium平台对2名正常与3名青光眼供体（79–88岁）的LC细胞进行scRNA-seq，经质控保留6131个细胞；以Seurat完成基于共享最近邻（shared nearest-neighbour, SNN）聚类的降维与UMAP可视化；以SingleR及GTEx参考数据集鉴定细胞身份；以基因集富集分析（Gene Set Enrichment Analysis, GSEA）评估通路富集，以i-cisTarget分析转录因子（transcription factor, TF）基序富集，以VIPER结合GENIE3算法推断母调控子（master regulon）；以独立供体（另6名正常与6名青光眼供体）经RT-qPCR、蛋白质印迹、免疫组织化学及免疫荧光验证（2
?ΔCT法归一化）；以整合应激反应（integrated stress response, ISR）抑制剂ISRIB（1 μM）与ER应激抑制剂4-苯基丁酸（4-PBA, 200 μM）进行药理学干预，MTT与MTS法评估细胞活力与代谢活性。研究共纳入10名正常与13名青光眼供体。
研究结果：
2.1 转录分组分析：SNN聚类与UMAP将6131个LC细胞分为四个广泛转录分组，全部青光眼细胞均落入第4组。该组高表达收缩相关基因（TAGLN、MYL9、MYL12B等）、经典ECM/结缔组织基因（COL1A1、ELN、POSTN、THBS1、DCN、LUM等）及促纤维化基因（TGFβ1、PDGFRB、TIMP-3、S100A4、GREM1、LOX），呈肌成纤维细胞（myofibroblast）样表型；第3组（全部来自正常供体）高表达PDPN、MMP2、MMP14等ECM降解酶；第1、2、3组分别富集mTORC1、TNFα/NF-κB与缺氧信号，第4组富集E2F靶基因、G2M检查点与Myc靶基因V1通路；Hallmark EMT基因集在四组均富集；细胞周期回归后98.57%细胞分组不变，SingleR与GTEx分析确认LC细胞为成纤维细胞/间充质来源；凝胶收缩实验显示正常细胞经TGF-β1预处理及青光眼LC细胞收缩活性均增强。
2.2 正常与青光眼数据分析：青光眼LC细胞823个基因显著过表达、1092个基因下调；GSEA显示E2F靶基因、G2M检查点、Hallmark EMT基因集、MYC靶基因V1及TGFβ信号富集，p53通路与雌激素应答晚期通路下调；供体水平伪整体分析（DESeq2）鉴定767个差异基因，与MAST结果高度一致（Spearman r = 0.78）；独立验证显示KRT18与THBS1在青光眼细胞中升高，E2F1、RAD54L、MYC、SNAI1表达增加。
2.3 转录因子分析：VIPER分析显示HMGB1、HMGB2、CENPA等细胞周期相关母调控子过表达、TCF25下调；i-cisTarget发现血清反应因子（serum response factor, SRF）为最富集TF（前30个富集区域中占25个），MEF2（A–D）家族与AP-1家族（FOSL2、JUN）亦富集；GCN4（ATF4同源物）、ATF3、CREB3L1、ATF6b等ER/未折叠蛋白反应（ER/UPR）/ISR组分过表达。
2.4 i-cisTarget与整合应激反应：SRF在青光眼LC细胞中过表达；ATF4、CHOP、GRP78在青光眼LC细胞及人青光眼ONH组织中升高并与α-SMA共定位，p-EIF2α水平升高（eIF2B为ISRIB作用靶点）。ISRIB与4-PBA均降低ATF4、CHOP、GRP78蛋白水平及COL1A1、α-SMA表达；ISRIB以剂量和时间依赖性降低细胞代谢活性（1 μM、24 h最显著），并逆转青光眼LC细胞96 h的代谢活性升高。
讨论：讨论指出，第4组代表促纤维化肌成纤维细胞样群体，GREM1升高与既往青光眼ONH报告一致，ECM降解酶相对缺乏可能是青光眼LC纤维化与僵硬的关键；正常供体细胞亦见于各组，提示部分正常细胞表达肌成纤维细胞标记，与筛板终身承受生物力学应力相符；mTORC1与TNFα/NF-κB信号可能具有抑制成纤维细胞活化的"保护性"作用；E2F、G2M与c-MYC富集提示增殖性转录程序是纤维化中活化成纤维细胞的共同特征，p53通路下调与肌成纤维细胞凋亡失败相关；SRF及MRTF/SRF通路驱动肌成纤维细胞活化；药理学调节ISR/ER应激可减轻纤维化表型。研究同时存在供体数量少、临床信息缺乏、基于体外培养细胞、MTS反映代谢活性而非直接测量增殖等局限，结论需在更大独立供体队列中验证。
研究结论：本研究表征了正常与青光眼眼人类LC细胞的转录变化，并鉴定了参与ONH重塑的信号通路。结果支持培养的LC细胞呈现成纤维细胞/收缩性肌成纤维细胞表型，特征为ECM基因表达增加及细胞周期相关转录程序改变；ISR/ER应激相关信号与青光眼LC表型存在潜在关联，ISRIB与4-PBA药理学调节与多种应激反应及ECM相关基因表达降低相关。研究支持对ISR/ER应激通路及其药理学调节在LC重塑中作用的进一步探究，但未确立ISR激活、LC纤维化与ONH杯状凹陷之间的直接因果关系。
