《International Journal of Molecular Sciences》：scLAP: A Liver-Adapted Contrastive Shared-Latent Framework for Pseudo-Pairing Single-Cell Transcriptomes and Chromatin Accessibility Profiles
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在肝细胞癌（hepatocellular carcinoma, HCC）中，来自同一细胞的单细胞RNA测序（single-cell RNA sequencing, scRNA-seq）谱与单细胞转座酶可及性染色质测序（single-cell assay for
在肝细胞癌（hepatocellular carcinoma, HCC）中，来自同一细胞的单细胞RNA测序（single-cell RNA sequencing, scRNA-seq）谱与单细胞转座酶可及性染色质测序（single-cell assay for transposase-accessible chromatin sequencing, scATAC-seq）谱的配对数据仍然有限，阻碍了细胞分辨率下转录程序与调控性染色质状态的整合。为应对这一挑战，研究人员开发了单细胞肝适配比对与伪配对（single-cell Liver-adapted Alignment and Pseudo-pairing, scLAP）方法，即一种肝适配的对比共享隐空间（contrastive shared-latent）框架，用于跨研究的RNA-ATAC伪配对。scLAP在配对的肝脏单细胞核多组学（single-nucleus multiome）参考数据集上训练，使用2000个高变RNA特征与697个ATAC特征，包括647个转录因子（transcription factor, TF）motif活性评分与50个潜在语义索引（latent semantic indexing, LSI）组分。在预设的细胞水平测试分区（n = 3235）上，scLAP的ATAC-to-RNA Top 10精确配对检索率达到21.48%，平均真实匹配邻近样本比例（fraction of samples closer than the true match, FOSCTTM）为0.0431。在六个留一样本（leave-one-sample-out）折中，相应的宏平均（macro mean）分别为5.23%与0.2278，表明其排序优于随机水平，但精确配对向未见样本的迁移能力有限。经验证集筛选的scButterfly配置（使用20,000个天然ATAC peak）在同一批测试细胞上取得8.93%的Top 10检索率与0.0811的平均FOSCTTM；与Con-AAE及scMODAL的比较仍属于研究内适配。将互易检索（reciprocal retrieval）、验证集衍生的余弦相似度（cosine-similarity）阈值与贪心一对一分配（greedy one-to-one assignment）应用于独立的HCC数据集，得到4007个经相似度过滤的候选RNA-ATAC伪配对。下游分析鉴定出一个NRCAM相关可及性候选位点，以及与MET、CAV1和AP-1相关的独立探索性观察结果。
研究背景
原发性肝癌（primary liver cancer, PLC）是全球重大且日益增加的健康负担，也是癌症相关死亡的主要原因之一。肝细胞癌（hepatocellular carcinoma, HCC）约占PLC病例的90%，通常发生在慢性肝损伤（由病毒性肝炎、酒精相关肝病或代谢功能障碍相关脂肪性肝病所致）背景下。HCC进展由遗传与表观遗传改变以及恶性细胞、基质区室与免疫群体间的复杂相互作用共同塑造，因此需要在细胞分辨率上解析这些相互作用，以理解肿瘤演化并识别治疗脆弱性。单细胞RNA测序（single-cell RNA sequencing, scRNA-seq）已显著推进了肝癌细胞多样性的表征，但转录组仅是肿瘤生物学的一个不完全层面：它较染色质顺式调控程序更直接地捕获细胞状态，而后者可能先于或维持转录状态。整合转录组与染色质可及性谱可将基因表达变化与其潜在调控机制相连接。然而，配对RNA-ATAC测量在临床队列（包括PLC）中仍然有限，而独立生成的scRNA-seq与单细胞ATAC测序（single-cell assay for transposase-accessible chromatin sequencing, scATAC-seq）数据日益增多，这产生了对能够跨独立数据集恢复可追溯RNA-ATAC细胞配对的计算策略的实际需求。scButterfly、scMODAL与Con-AAE等深度学习方法为跨模态整合奠定了重要基础，但其主要目标与跨研究RNA-ATAC伪配对不同：跨模态翻译与一对一细胞检索是相关但不同的目标；用于关联特征构建的基因活性摘要可能不完全捕获远端增强子信息；利于对比整合的注释在临床数据集间可能不一致或不可用；peak空间在研究间可差异巨大。这些挑战反映的是领域迁移问题，而非原始框架的普适性局限。针对该问题，研究人员开发了scLAP（single-cell Liver-adapted Alignment and Pseudo-pairing，单细胞肝适配比对与伪配对），一种肝适配对比共享隐空间框架：从配对肝脏多组学参考学习RNA-ATAC细胞对应关系，通过相似度过滤的互易匹配与一对一分配在独立队列中构建候选伪配对。研究证实scLAP在预设细胞水平分区上保留了精确细胞检索结构，并在固定测试分区上优于对照方法；但精确配对向未见样本的迁移有限。应用于独立HCC数据集生成4007个候选伪配对，鉴定出NRCAM相关可及性候选及独立的MET、CAV1、AP-1相关探索性观察，为跨独立数据集整合转录组与染色质信息提供了可追溯的计算路径。
关键方法
scLAP在配对肝脏单细胞多组学参考GSE223843（六个样本，按细胞随机分为训练15,095、验证3,234、测试3,235个细胞）上训练，外部HCC数据含scRNA-seq的GSE125449、GSE151530、GSE189903与scATAC-seq的GSE227265。RNA端取2000个高变基因；ATAC端基于500 bp共识peak经TF-IDF与LSI取50个组分，以JASPAR2022 CORE PWM扫描计算647个TF motif活性，共697维。模型为双残差MLP编码器加模态特异投影头与解码器，三阶段训练采用对称InfoNCE、难负样本损失、Sinkhorn损失、VICReg、循环一致性与Smooth L1损失。伪配对经互易Top K检索、验证集q75余弦阈值（0.815683）与贪心一对一分配实现；下游用Seurat、ArchR及以fragment library为阻断的edgeR模型分析。
研究结果
2.1 预设细胞水平分区上的配对细胞检索及研究内基线适配
在预设配对肝脏细胞水平测试分区（n = 3235）上，scLAP的ATAC-to-RNA Top 10精确配对检索率达21.48%，Top 1为4.82%，平均真实匹配邻近样本比例（fraction of samples closer than the true match, FOSCTTM）为0.0431；验证集结果相近。六个源样本均出现于每个分区，故结果量化的是参考内细胞水平检索，未建立对未见供体或样本的泛化。六个留一样本折的宏平均Top 1与Top 10检索率为0.90%与5.23%（95% CI：0.20–1.60%与1.89–8.57%），平均FOSCTTM为0.2278，表明精确细胞向未见样本迁移有限。验证衍生q75阈值在固定测试分区上保留2320个细胞中的106个精确配对，对应4.57%精确率、3.28%召回率与71.72%覆盖率，96.12%保留配对共享同一源样本标签，说明过滤规则捕获样本与细胞状态邻近性甚于精确细胞身份。受控消融显示对称InfoNCE为影响最大的组件。与scButterfly（8.93% Top 10、0.0811平均FOSCTTM）、Con-AAE（1.64%）及scMODAL（0.68%）相比，scLAP在该固定数据集上更优，但不构成对发表方法的普遍优势。
2.2 独立非配对HCC数据集中相似度过滤候选伪配对的生成
将冻结模型应用于独立HCC数据（scRNA-seq来自GSE125449、GSE151530、GSE189903；scATAC-seq来自GSE227265），互易Top 10检索、q75余弦阈值与贪心一对一分配共产生4007个候选伪配对（互易Top 1与Top 5分别产生934与2881对）。候选RNA锚点含2514个GSE151530、1074个GSE189903与419个GSE125449细胞，涵盖1412个恶性细胞、919个T细胞、512个肿瘤相关巨噬细胞、210个癌症相关成纤维细胞、167个肿瘤内皮细胞、109个肝祖细胞样细胞、44个B细胞与634个未分类细胞。用Seurat工作流重处理原始count矩阵后，细胞按主要肿瘤与微环境区室分离，差异标志分析回收预期标志物（如恶性细胞的ALB、GPC3、AFP、TOP 2A，TAM的SPP1、APOE，T细胞的CD3D、CD8A等），队列敏感性分析显示池化与分队列匹配存在依赖队列的候选竞争。
2.3 伪配对ATAC谱凸显细胞状态调控程序
为避免标签泄漏，共识peak空间在RNA标签转移前由全部55,421个合格ATAC细胞构建，最终71,862个peak产生2931个标志peak、3802个标志GeneScores与47,380个共可及性链接。以fragment library为阻断因子的edgeR拟似差分析发现T细胞、CAF、TAM与恶性细胞组存在显著差异peak，TEC与HPC-like组无显著peak。RNA标签盲一致性检查显示最高评分ATAC标志panel与相应广谱RNA谱系一致的比例为30.00%，高于置换平均22.16%（P = 0.00050），支持优于无效的聚集谱系结构，但不验证精确细胞对应。motif富集显示恶性细胞peak富集AP-1相关motif（FOSL2、FRA2、ATF3、AP-1、JUN/AP1），T细胞富集RUNX与ETS家族，TAM富集SPIB与PU.1，CAF富集KLF14、SP1与RFX。探索性分析在恶性标签细胞中鉴定出MET与CAV1附近的开放区域；NRCAM最近内含子peak（chr7:108358443–108358943）满足预设显著性标准（log2FC = 4.885，FDR = 0.00126），但该可及性关联不建立NRCAM的表达、功能或因果性；留一库分析log2FC在全部九次拟合中均为正（4.253–5.537），但多重检验校正后的显著性对排除单个文库不完全稳健（排除库20或库5时FDR升至0.824或0.278）。
讨论与结论
讨论部分指出，scLAP明确针对互易细胞检索与一对一分配，不同于以跨模态重建或隐空间对齐为主要目标的方法；在配对肝脏参考的预设细胞水平分区上保留了精确细胞与样本级结构，并在固定测试分区上优于验证筛选的天然peak scButterfly配置与研究内适配的Con-AAE和scMODAL；但留一样本分析显示未见样本的精确配对检索大幅下降，划定了模型当前的泛化边界。研究局限包括：配对参考仅含六个源样本，限制患者间、疾病状态与技术异质性的覆盖；特征基础为transductive；验证标定的q75过滤在71.72%覆盖率下仅4.57%精确率（q99阈值亦仅16.35%精确率、3.21%覆盖率）；池化的RNA队列与ATAC文库在组成和技术处理上不同；RNA转移的ATAC标签并非独立金标准。未来工作将扩展配对肝脏与HCC多组学参考、将特征构建隔离于训练折内，并结合独立ATAC注释与正交生物学验证优化模型。
研究结论：scLAP是一种肝适配对比共享隐空间框架，用于构建独立生成的scRNA-seq与scATAC-seq数据集之间的候选RNA-ATAC伪配对。研究证实，在配对肝脏参考的预设细胞水平分区上，scLAP保留了精确细胞与样本级结构，并在固定测试分区上优于对照方法；但向未见样本的精确配对迁移有限。应用于独立HCC数据集，scLAP生成了4007个跨越恶性、免疫与间质区室的候选伪配对，支持探索性的细胞组成与调控分析，包括NRCAM相关可及性候选位点及独立的MET、CAV1与AP-1相关观察，这些结果均需进一步独立验证。
