超声辅助无机三元低共熔溶剂（DES）预处理协同双交联与双多酚负载构建多功能大豆分离蛋白–壳聚糖（SPI–CS）可降解保鲜膜

《Polymers》：Preparation and Properties of Deep Eutectic Solvent-Modified Soy Protein and Soy Protein–Chitosan Composite Films

　　

常规不可降解塑料包装造成严重环境污染，推动了对可降解生物质食品包装的需求。壳聚糖（CS）是理想的绿色成膜材料，但力学性能、耐水性和抗氧化性能较弱。大豆分离蛋白（SPI）廉价且来源丰富，然而其致密的分子结构导致与纯CS的混溶性较差。本研究采用超声辅助低共熔溶剂（DES）预处理展开SPI的蛋白质结构并释放活性位点，以增强SPI–CS界面相互作用。柠檬酸和转谷氨酰胺酶（TG）作为双重绿色交联剂，同时添加香芹酚（Car）和没食子酸（GA）作为天然多酚抗氧化剂。通过单因素和Box–Behnken响应面试验确定最佳成膜参数：柠檬酸质量比为0.84、TG用量为2.60 U?g?1、干燥温度为65 °C。优化后的DES–SPI–CS膜具有18.79 MPa的拉伸强度和41.39%的断裂伸长率，耐水性和热稳定性大幅提高。共负载Car和GA后，复合膜的DPPH自由基清除活性达到79.33%。为期12天的樱桃番茄保鲜试验证实其能够减缓维生素C损失和果实腐烂。本研究提供了一种结合DES改性、双交联和天然抗氧化剂掺杂的可持续集成策略，用于制备多功能生物基包装材料，为可生物降解膜替代一次性塑料提供了理论支持。

研究背景：常规石油基塑料包装材料引发严重的生态污染，促使可再生、可生物降解食品包装替代品的研究日益增多。大豆分离蛋白（SPI）作为一种廉价易得的生物质蛋白，其内部紧密堆积的分子结构屏蔽了反应性功能基团；SPI与壳聚糖（CS，脱乙酰度≥95%）的简单物理共混界面相容性差，损害了复合膜的综合性能。壳聚糖是环保型成膜基体，但纯壳聚糖膜力学强度不足、耐水性不理想，限制了其工业应用。现有改性策略主要包括与其他可降解聚合物共混、使用绿色溶剂（离子液体和低共熔溶剂）以及添加增塑剂，但多数仅针对CS基体改性或简单添加单一功能组分，未能解决蛋白质与多糖相间的本征界面不相容问题。此外，现有研究多集中于单一多酚掺入，较少探索两种不同多酚作为共组分在DES预处理及双交联SPI–CS复合基体中的联合效应。因此，研究人员开展本研究以同时改善界面相容性、力学性能、耐水性和抗氧化活性。

研究内容与结论：研究人员采用超声辅助三元DES（ZnCl₂-H₃PO₄-H₂O）预处理SPI以展开其致密结构并暴露反应位点，随后以柠檬酸和转谷氨酰胺酶（TG）构建双交联SPI–CS网络，并共负载香芹酚（Car）和没食子酸（GA）两种天然多酚。通过单因素试验和Box–Behnken响应面法（BBD-RSM）优化成膜参数，获得拉伸强度18.79 MPa、断裂伸长率41.39%的复合膜，耐水性和热稳定性显著提升；共负载Car和GA后DPPH自由基清除率达79.33%；12天樱桃番茄保鲜试验证实其可减缓维生素C损失和果实腐烂。该研究为多功能可食性包装膜建立了集成改性路径，为蛋白–多糖生物复合材料替代一次性塑料包装提供理论支持。

关键技术方法（不超过250字）：采用ZnCl₂:H₃PO₄:H₂O=1:0.6:2.5（摩尔比）三元DES于60 °C、5 h预处理SPI，结合超声细胞破碎（300 W、20 kHz、间歇模式、15 min）；以考马斯亮蓝G-250法测定可溶性蛋白含量进行单因素优化；采用动态光散射（DLS）、傅里叶变换红外光谱（FTIR）、X射线衍射（XRD）表征预处理SPI；以Box–Behnken设计优化柠檬酸质量比、TG用量和成膜温度；通过万能材料试验机测力学性能，接触角与溶解度评价耐水性，扫描电镜（SEM）观察微观形貌，热重（TG/DTG）分析热稳定性，DPPH法测抗氧化活性；樱桃番茄于25±2 °C、50–55%相对湿度下贮藏12天，测定维生素C、失重率、腐烂率和感官评分。新鲜樱桃番茄购自中国吉林当地市场。

研究结果：

3.1 预处理条件优化：可溶性蛋白含量在H₃PO₄摩尔比0.6、H₂O摩尔比2.5、反应时间5 h、温度60 °C、超声15 min时最高；适度酸性有效破坏SPI氢键网络而不引发过度聚集。

3.2 预处理SPI的结构表征：DLS显示平均粒径由408 nm减小，大峰减弱并向小尺寸移动；FTIR显示3420 cm^?1的O–H/N–H伸缩带和505–540 cm^?1二硫键带强度明显减弱，酰胺I、II、III带位置基本不变且无新吸收带，表明DES-超声破坏高级结构和分子间作用而未损伤主链；XRD显示2θ≈9°和20°特征峰减弱，有序域相对含量由20.57%降至15.34%（相对降幅约25.4%），大于文献报道的尿素（19.36%）和SDS（11.26%）改性大豆蛋白。

3.3 预处理SPI膜的力学性能：拉伸强度由7 MPa升至13.3 MPa，断裂伸长率由21.9%升至37.57%；与纯CS膜相比，DES–SPI–CS膜拉伸强度和断裂伸长率分别提高20%和195.06%。

3.4 交联膜响应面优化：柠檬酸质量比与TG用量交互作用呈椭圆形等高线；成膜温度对拉伸强度的影响强于柠檬酸质量比和TG用量；对断裂伸长率，柠檬酸影响强于温度，温度影响强于TG。最优参数为柠檬酸质量比0.84、TG 2.60 U?g^?1、成膜温度65 °C，此时拉伸强度18.79 MPa、断裂伸长率41.39%。

3.5 溶解度与接触角：膜溶解度随柠檬酸含量增加先降后升；随TG用量增加单调下降；45–65 °C范围内温度无明显影响；水接触角由未交联的58°升至双交联的74°，膜仍具亲水性但表面疏水性增强。

3.6 交联膜性能分析：色差方面，交联SPI–CS膜较CS单膜L、a降低、b升高，呈偏绿偏黄色调；较DES–SPI单膜L、a升高、b降低；普通膜与交联膜色差极小。SEM显示交联后膜表面更致密、孔隙减少，无裂纹和相分离。FTIR显示双交联膜O–H和N–H峰红移，1632 cm^?1β-折叠吸收减弱、酰胺II峰位移，1700–1750 cm^?1无新羰基带，表明无酯键形成，交联主要来自TG催化的异肽键及柠檬酸的离子和氢键桥接。TG/DTG显示三个失重阶段（50–150 °C自由水和结合水挥发、150–330 °C分子链热裂解、330–600 °C缓慢碳化），双交联膜残留质量分数23%高于未交联的18%，DTG失水峰向高温移动且强度升高，表明致密网络锁住更多结合水。

3.7 抗氧化负载膜的力学与抗氧化性能：拉伸强度为香芹酚组14.19 MPa、GA组9.76 MPa、复合组13.32 MPa，均低于对照；香芹酚作为增塑剂使断裂伸长率升至72.37%，GA则略降低断裂伸长率。DPPH清除率随香芹酚由0%增至2.5%由39.88%升至65.83%，GA在2.5%时达70.89%；共负载2.5% Car和2.5% GA的膜清除率为79.33%，低于净效应理论加和值96.84%和Bliss独立模型估计值90.05%，表明无抗氧化协同作用，研究人员推测为酚羟基间竞争性供氢及香芹酚疏水性导致的水相释放较慢所致。

3.8 保鲜应用分析：第12天双抗氧化膜组维生素C保留42.6 mg/100 g，高于空白组的31.2 mg/100 g；失重率最低为21.22%，空白组为32.82%；腐烂指数仅37.5%，空白组达62.5%；感官评价显示双多酚膜组第8天才出现明显表皮皱缩，贮藏末期近半数果实仍保持完好商品外观。

讨论部分总结：结构和光谱结果表明，超声辅助无机三元DES主要通过破坏维持SPI致密结构的非共价和共价相互作用发挥作用，而非化学修饰多肽；与起始结晶度相近（约20%）的其他体系相比，本体系有序域相对降幅更大（25.4%），且避免使用有机氢键供体。核心发现是65 °C温和成膜条件下柠檬酸未与SPI/CS羟基形成酯交联，这与柠檬酸酯化需约140 °C加热加催化剂的条件一致，共价网络主要由TG催化的SPI链间异肽键提供，纠正了温和温度蛋白膜中常被误判为柠檬酸酯交联的机制。香芹酚与没食子酸组合无协同抗氧化作用，与文献报道的协同效应不一致，为生物基包装中酚类抗氧化剂复配的常见假设提供了反例。尽管体外无协同，共负载膜仍具最佳保鲜效果，归因于两种多酚各自的抗菌活性及双交联基体改善的耐水性和结构完整性。研究局限性包括：未定量残留DES组分（Zn²⁺、Cl^?和磷酸盐）及其向食品模拟物的迁移，膜尚不能认定为可食或食品接触安全；未进行水蒸气及O₂/CO₂透过率、膜DSC、溶剂共晶点DSC确认和直接微生物计数；未定量预处理沉淀的干基回收率；缺少未包装对照；交联网络的定量验证及放大规模下的工艺稳定性和成本有待解决。

结论翻译：本研究通过将超声辅助三元DES预处理与柠檬酸/转谷氨酰胺酶双交联相结合，开发了一种多功能SPI–CS复合膜。主要发现如下：（1）低成本无机ZnCl₂-H₃PO₄-H₂O DES耦合超声有效解聚SPI并展开其有序域（有序域相对含量由20.57%降至15.34%），且不损伤蛋白质一级结构。（2）在65 °C温和成型条件下，FTIR未检测到柠檬酸与SPI/CS羟基之间的酯键形成；双交联网络主要通过TG催化的SPI链间共价异肽键（可能包括SPI–壳聚糖连接）以及柠檬酸介导的离子和氢键相互作用建立。（3）香芹酚和没食子酸共掺入的DPPH清除率为79.33%，低于理论加和值96.84%，表明无抗氧化协同作用，但双抗氧化膜仍实现了樱桃番茄的有效长期保鲜。该膜在水基、可生物降解体系中温和条件下制备，有望成为可持续生物基包装候选材料，但食品接触使用前需确认残留溶剂水平和迁移合规性。