去泛素化酶UCHL1通过稳定角蛋白18促进胶质瘤放疗抵抗的机制研究

《International Journal of Molecular Sciences》：The Deubiquitinating Enzyme UCHL1 Promotes Radiotherapy Resistance in Glioma by Stabilizing Keratin 18

　　

摘要：维持胶质瘤干细胞（GSCs）的干性特征以及强大的DNA损伤修复能力，是决定胶质瘤放疗抵抗的关键因素。尽管去泛素化酶泛素羧基末端水解酶L1（UCHL1）已被证实参与调控肿瘤细胞功能并促进恶性进展，但其在维持GSCs干性和促进放疗抵抗中的具体作用仍不清楚。在本研究中，研究人员结合公共数据集的二次分析与内部实验探究。具体而言，研究人员首先利用GEO2R、GEPIA2和CGGA数据库分析了UCHL1在胶质瘤中的表达及其预后意义。通过克隆形成存活、彗星实验、成球实验、极限稀释分析和蛋白质印迹法评估了放射敏感性、DNA修复能力和GSCs干性。为了鉴定UCHL1相互作用蛋白，进行了免疫共沉淀联合质谱分析，随后通过去泛素化和拯救实验验证其底物和功能依赖性。研究结果显示，UCHL1在放疗抵抗的胶质母细胞瘤细胞和胶质瘤组织中显著过表达，其表达水平与胶质瘤患者的不良预后呈正相关。敲低UCHL1削弱了GSCs的成球能力和自我更新频率，并损害了照射后细胞对DNA损伤的应答，从而减弱了放疗抵抗表型。机制上，UCHL1通过去泛素化稳定角蛋白18（KRT18）蛋白。在敲低KRT18后，UCHL1对放疗抵抗和干性特性的影响大部分消失，同时伴随干性标志物SOX2表达的降低。此外，敲低KRT18减弱了由UCHL1过表达诱导的放疗抵抗表型。总之，这些发现揭示了一个UCHL1可能通过调节GSCs干性和放疗抵抗的机制轴，并将UCHL1确定为逆转胶质瘤治疗抵抗的候选治疗靶点，有待进一步验证。

一、研究背景与目的

胶质瘤是中枢神经系统最常见且最具侵袭性的原发性恶性肿瘤。尽管手术切除联合放化疗已成为标准治疗方案，但电离辐射的治疗抵抗仍是导致患者预后不良和肿瘤频繁复发的关键因素。传统化疗药物虽重要，但常伴有神经毒性等严重副作用，因此亟需开发更精准、低毒的治疗策略。放疗主要通过诱导致死性DNA损伤发挥细胞毒性作用，而肿瘤细胞常利用其强大的DNA损伤修复（DDR）能力，这是驱动放疗抵抗的主要机制。在异质性胶质瘤肿块中，胶质瘤干细胞（GSCs）亚群具有卓越的DDR和自我更新能力，是肿瘤持续存在和深度放疗抵抗的主要驱动者。近年研究表明，表观遗传调控和蛋白质翻译后修饰在维持GSCs干性和调节DDR中发挥重要作用，但精确的分子事件仍不明确。

泛素-蛋白酶体系统（UPS）通过精确调控关键蛋白稳定性，控制着细胞周期、凋亡、DDR和干细胞分化等多种基本细胞过程。去泛素化酶（DUBs）通过去除底物蛋白上的泛素偶联物来对抗蛋白酶体降解，深刻影响关键癌蛋白的稳定化、DDR级联反应的调控以及癌症干细胞特性的维持。作为泛素C末端水解酶（UCH）家族成员，泛素羧基末端水解酶L1（UCHL1）主要作为一种去泛素化酶，稳定多种癌蛋白。UCHL1在前列腺癌、宫颈鳞状细胞癌和三阴性乳腺癌等多种恶性肿瘤中高表达，通过调节癌症干细胞特性、增殖、迁移和侵袭促进恶性进展。然而，UCHL1在胶质瘤放疗抵抗中的具体贡献尚待阐明。

本研究旨在鉴定UCHL1作为介导治疗抵抗的因子，探讨其在维持干性和细胞DNA损伤应答中的作用，并表征其功能和机制，确定角蛋白18（KRT18）为UCHL1此前未被识别的去泛素化底物。

二、主要关键技术方法

研究人员使用了GEO2R、GEPIA2和CGGA等公共数据库进行生物信息学分析。通过慢病毒介导的shRNA干扰建立稳定敲低或过表达UCHL1的胶质母细胞瘤（GBM）细胞系。采用克隆形成存活实验评估放射敏感性；彗星实验评估DNA损伤修复能力；成球实验和极限稀释分析（ELDA）评估干性维持和自我更新能力。通过免疫共沉淀（Co-IP）联合质谱（MS）筛选并鉴定UCHL1相互作用蛋白，并通过泛素化实验和拯救实验验证底物及功能依赖性。临床胶质瘤组织标本来自苏州大学附属儿童医院。

三、研究结果

2.1 UCHL1表达与胶质瘤放疗抵抗正相关

通过比较四种GBM细胞系的放射敏感性，发现U251细胞相对放疗抵抗，LN229细胞相对放射敏感。MG132处理可增加放疗抵抗细胞的克隆形成效率，表明UPS介导的蛋白稳态维持了放疗抵抗表型。通过交集分析放疗抵抗相关GEO数据集与UPS相关基因，鉴定出去泛素化酶UCHL1在放疗抵抗组中一致上调。Kaplan-Meier生存分析显示，UCHL1高表达胶质瘤患者的总生存期和无进展生存期显著缩短。UCHL1蛋白和mRNA水平在放射敏感的LN229细胞中最低，在放疗抵抗的U251细胞中最高。临床标本免疫组化染色证实，UCHL1在放疗抵抗组中的表达高于放射敏感组。

2.2 UCHL1调控GBM细胞的放射敏感性和DNA修复能力

在U251细胞中敲低UCHL1后，克隆形成存活率剂量依赖性降低，ED₅₀值显著下降，表明放疗抵抗减弱。相反，在LN229细胞中过表达UCHL1增强了放疗抵抗。彗星实验显示，敲低UCHL1后，照射后18小时和30小时的残余DNA损伤比例显著升高，而过表达则减轻了DNA损伤反应，表明UCHL1缺陷改变了DNA损伤应答动力学。通过逐步递增剂量照射建立的放疗抵抗亚株U251R和LN229R中，UCHL1蛋白水平显著上调。

2.3 UCHL1维持干性特性和自我更新能力以促进GBM细胞放疗抵抗

敲低UCHL1显著降低了U251细胞的基础成球直径和数量，照射后这些参数进一步减小；过表达则增强成球能力。极限稀释分析显示，敲低UCHL1使成球频率从1/128降至1/512，而过表达则从1/256升至1/64。蛋白质印迹和qRT-PCR显示，UCHL1与干性标志物SOX2的表达呈正相关：敲低UCHL1降低SOX2蛋白和mRNA水平，过表达则反之。免疫荧光染色进一步确认了这一模式。在放疗抵抗细胞中，SOX2转录本水平也显著升高。

2.4 KRT18被鉴定为UCHL1的新型相互作用蛋白

通过在U87MG细胞中建立UCHL1-Flag过表达系统并进行免疫沉淀质谱分析，鉴定出9种差异相关蛋白。将这些蛋白与Genecards数据库中注释为DNA损伤修复和干性维持的基因取交集，得到KRT18。Co-IP实验在293T细胞中验证了UCHL1与KRT18的直接相互作用。蛋白质印迹显示，敲低UCHL1降低KRT18蛋白水平，过表达则升高。放线菌酮（CHX）追踪实验显示KRT18蛋白随时间递减，MG132干预实验证实KRT18经泛素-蛋白酶体途径降解。在敲低UCHL1的细胞中，CHX处理显著缩短了KRT18蛋白的半衰期，表明UCHL1通过其去泛素化活性维持KRT18蛋白稳定性。

2.5 UCHL1通过K48连接的泛素链去泛素化稳定KRT18

通过共转染KRT18与各种HA标记的泛素突变体，发现UCHL1优先去除KRT18上的K48连接泛素链。使用赖氨酸残基突变为精氨酸（KR突变体）进一步证实，K48R突变体的泛素化信号抵抗UCHL1介导的去除。将野生型（WT）或催化失活型（C90S）UCHL1与KRT18共转染，Co-IP显示野生型UCHL1显著降低KRT18的泛素化信号，而C90S突变体无此效应，表明UCHL1的去泛素化酶活性对于KRT18的去泛素化是必需的。

2.6 KRT18是UCHL1相关胶质瘤放疗抵抗所必需的

在过表达UCHL1的LN229细胞中敲低KRT18，克隆形成实验显示，UCHL1过表达使ED₅₀值从4.12 Gy升至6.13 Gy，而KRT18敲低使其回落至4.41 Gy，减弱了放疗抵抗表型。成球实验显示，KRT18敲低削弱了UCHL1过表达增强的成球能力。蛋白质印迹显示，KRT18敲低也降低了SOX2蛋白水平。临床标本免疫组化显示，KRT18在放疗抵抗组中表达更高。CGGA数据库分析显示，复发肿瘤中KRT18表达高于原发肿瘤。Kaplan-Meier分析表明，KRT18高表达患者总生存期和无进展生存期更短。UCHL1和KRT18均高表达的患者生存期最短。

四、讨论与结论

本研究揭示了去泛素化酶UCHL1在胶质瘤放疗抵抗中的重要贡献。临床数据显示UCHL1在放疗抵抗的胶质瘤组织中显著过表达，其表达与患者不良预后和肿瘤复发密切相关。机制上，UCHL1直接结合KRT18并特异性去除其K48连接的多聚泛素链，抑制蛋白酶体降解，稳定KRT18蛋白。这种稳定化伴随着SOX2介导的干性特性增强和细胞DNA损伤应答的改变，共同促进了放疗抵抗。功能拯救实验表明，KRT18敲低减弱了UCHL1过表达诱导的SOX2上调、干性增强和放疗抵抗表型，表明KRT18作为UCHL1介导放疗抵抗的下游效应分子。

研究结论：本研究鉴定了UCHL1通过去泛素化介导的KRT18稳定化促进胶质瘤放疗抵抗的机制，该机制进而上调SOX2介导的干性特征并调节细胞对DNA损伤的应答。鉴于UCHL1具有可药用的催化结构域，开发特异性的UCHL1小分子抑制剂联合放疗可能是克服胶质瘤放疗抵抗的潜在治疗策略。