《International Journal of Molecular Sciences》：Cross-System miRNA Profiling Identifies a Clinically Recurrent miRNA Core in Colorectal Cancer
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结直肠癌（CRC）涵盖生物学上多样的细胞表型，并具有不同的microRNA（miRNA）表达模式。评估源自细胞模型的改变是否在细胞外囊泡（EVs）和人类肿瘤中重现，可能有助于优先筛选与CRC具有更广泛相关性的候选分子。研究人员对非恶性HCoEpiC细胞、分化的
结直肠癌（CRC）涵盖生物学上多样的细胞表型，并具有不同的microRNA（miRNA）表达模式。评估源自细胞模型的改变是否在细胞外囊泡（EVs）和人类肿瘤中重现，可能有助于优先筛选与CRC具有更广泛相关性的候选分子。研究人员对非恶性HCoEpiC细胞、分化的肠上皮细胞样Caco-2细胞、分化程度较低的HCT116细胞及其相应EVs进行了小RNA测序。在两种CRC细胞系中相对于HCoEpiC表现出一致失调、且在HCT116中绝对log2倍数变化更大的miRNA被优先筛选，并在人类结直肠组织和TCGA-COAD/READ中接受评估。29个优先筛选的细胞miRNA中有7个符合EV筛选标准。在患者组织数据集中可检测的26个候选miRNA中，8个在CRC与健康结直肠组织之间显示出FDR显著的、方向一致的差异，其中5个在细胞、EVs和患者组织中均一致失调。对11对匹配的TCGA肿瘤–非肿瘤样本的分析重现了miR-30a-3p、miR-30c-2-3p和miR-1271-5p的降低以及miR-140-5p的升高。基于靶标的富集分析和探索性miRNA-mRNA相关性分析识别出与CRC相关信号通路及MYC相关、细胞周期、DNA修复和代谢程序的关联。未检测到与所评估的临床病理特征或总生存期的显著关联。总体而言，这些发现识别出一组可重现的CRC相关miRNA改变，并突出显示miR-30a-3p和miR-30c-2-3p表达降低是一种值得机制研究的复发性家族水平模式。
研究背景：结直肠癌（CRC）是一种异质性疾病，其发生发展涉及基因组、表观遗传及转录后调控等多层面分子改变。microRNA（miRNA）作为转录后调控因子，可影响增殖、凋亡、分化、迁移、侵袭和应激反应等多条通路，已有miR-143/145、miR-21、miR-135a/b及miR-200家族成员被证实与CRC的肿瘤生长、侵袭、转移和治疗反应相关。然而，目前存在的问题是：源自细胞模型的miRNA改变能否在生物学上不同的CRC模型、其释放的细胞外囊泡（EVs）以及人类结直肠肿瘤中重现尚不清楚；EV相关miRNA货物并不必然直接反映细胞内miRNA表达，因为存在选择性miRNA分选入EV的机制。因此，开展跨系统评估有助于筛选出与CRC具有更广泛相关性的候选改变。
研究内容与结论：研究人员以小RNA测序分析非恶性结肠上皮细胞HCoEpiC、分化程度较高的肠上皮细胞样Caco-2细胞、分化程度较低的HCT116细胞及其对应EVs的miRNA谱，优先筛选在两种CRC细胞系中一致失调且在HCT116中改变幅度更大的miRNA，再在健康结直肠（HC）、腺瘤性息肉（AP）和CRC组织中评估，并在TCGA-COAD/READ中独立验证，同时进行探索性miRNA-mRNA相关性分析。研究共筛选出29个细胞候选miRNA，其中7个符合EV筛选标准；26个可在患者组织数据集中检测，8个在CRC与HC间FDR显著且方向一致，其中5个（miR-138-5p、miR-30a-3p、miR-30c-2-3p、miR-1271-5p、miR-140-5p）在细胞、EVs和患者组织中一致失调，4个在TCGA中独立重现。研究未发现这些miRNA与所评估的临床病理特征或总生存期显著相关。其重要意义在于识别出一组可重现的CRC相关miRNA改变，并将miR-30a-3p和miR-30c-2-3p的一致降低确立为值得机制研究的复发性miR-30家族模式。
关键技术方法：研究采用小RNA测序（Illumina TruSeq Small RNA Sample Preparation Kit，HiSeq 2500平台，1×50 bp单端测序）分析细胞及EV相关miRNA；使用基于沉淀法的Total Exosome Isolation试剂分离EVs，并按MISEV2023建议进行分子、形态和颗粒表征；生物信息学分析采用nf-core/smrnaseq v1.0.0流程、DESeq2 v1.26.0差异表达分析及PCoA；miRNA–靶标互作检索使用multiMiR v1.28.0，KEGG通路富集使用clusterProfiler v4.14.6；患者组织数据来自既往发表的自建队列（GEO登录号：GSE160432，含HC n=20、AP n=19、CRC n=20），并在TCGA-COAD/READ（605例原发CRC、11例癌旁非肿瘤样本）中独立验证。
研究结果：
2.1 细胞miRNA谱揭示CRC细胞系中的共享改变：质控后细胞数据集保留852个miRNA，PCoA显示HCoEpiC与两种CRC细胞系明显分离，Caco-2与HCT116各自聚类，前两个主坐标分别解释43.3%和29.9%的变异。Caco-2中460个miRNA差异表达（277上调、183下调），HCT116中541个差异表达（352上调、189下调），两系共享差异表达miRNA共299个，其中222个方向一致（146个共同上调、76个共同下调）。按Δlog2FC四分位阈值进一步筛选，得到17个上调、12个下调共29个优先候选；时间特异性模型估计显示29个候选在24、48、72 h均保持原方向。
2.2 共享细胞-EV miRNA显示一致失调及CRC相关通路靶标富集：29个细胞候选在两种CRC细胞系EVs中评估后，7个符合标准（2个上调、5个下调），其中3个下调miRNA来自两个miR-30位点（MIR30A来源的miR-30a-3p和miR-30a-5p，MIR30C2来源的miR-30c-2-3p）。对实验验证靶基因的KEGG富集分析显示，上调与下调靶基因组均富集于Wnt和Hippo信号、细胞周期及黏着斑等CRC相关通路。
2.3 患者组织重现部分细胞模型miRNA改变：29个候选中有26个可在患者组织中检测，8个在CRC与HC合并比较中FDR显著且方向与细胞模型一致（miR-3200-3p、miR-616-5p、miR-140-5p、miR-5001-3p升高；miR-138-5p、miR-30a-3p、miR-30c-2-3p、miR-1271-5p降低），其中5个在细胞、EVs和患者组织中一致失调。腺瘤组分析显示miR-30a-3p在AP中已较HC降低（FDR q=0.00023），AP与CRC间无显著差异（q=0.895）；miR-30c-2-3p在AP与HC（q=0.833）及AP与CRC（q=0.141）间均无显著差异，不支持两者沿腺瘤-癌序列呈逐步下降。对222个两系一致失调miRNA的扩展分析中，205个可检测，26个在CRC与HC间同向显著（16个上调、10个下调）。
2.4 TCGA-COAD/READ中组织一致miRNA的独立评估：在605例原发CRC和11例配对癌旁样本中，4个miRNA差异表达与细胞模型及患者组织一致：miR-140-5p升高，miR-30a-3p、miR-30c-2-3p和miR-1271-5p降低，其中两个miR-30家族成员再次被独立重现。未发现与疾病侵袭性临床病理指标或总生存期的显著关联。miRNA-mRNA整合分析显示，与miR-30a-3p、miR-1271-5p、miR-138-5p和miR-616-5p负相关的基因富集于细胞周期相关程序（尤其G2/M检查点和有丝分裂纺锤体），MYC靶标、DNA修复和氧化磷酸化程序亦反复富集，尤其与miR-30a-3p、miR-30c-2-3p和miR-138-5p相关；这些为肿瘤水平的关联而非直接调控证据。
讨论部分总结：本研究识别出在细胞模型、EVs和人类结直肠组织中一致改变的CRC相关miRNA子集。细胞与EV改变的部分重叠可能既反映筛选标准，也反映由RNA结合蛋白和序列基序介导的选择性miRNA分选。跨系统评估将候选集缩小至复发性改变，其中miR-30a-3p和miR-30c-2-3p降低是最突出的家族水平模式。靶标通路富集与TCGA相关性分析提示与增殖、DNA修复和代谢程序（包括PI3K-Akt、黏着斑、黏附连接和p53信号）的潜在关联，但这些分析不能确立直接调控，全肿瘤表达谱相关性可能部分反映恶性、基质和免疫细胞组成的差异。研究指出miR-30家族具有依赖组织背景的双向作用，并强调同一家族成员及3p/5p链功能不可互换。其他候选如miR-138-5p、miR-1271-5p、miR-140-5p和miR-1224-5p的文献报道存在方向不一致，提示仅凭表达方向不足以判定促癌或抑癌作用。研究未发现跨系统重现性与所评估临床特征显著相关。局限性包括：候选筛选限于两种细胞模型并偏向HCT116中较大绝对改变；基础培养基、既往培养条件和增殖速率差异可能影响miRNA谱；基于沉淀法的分离可能共分离脂蛋白和蛋白-RNA复合物，未进行核酸酶保护实验，结果代表EV富集制备物而非纯囊泡内货物；条件培养基在24–72 h内未更换，EV输入按培养基体积而非供体细胞数或颗粒数标准化；患者队列较小；数据库靶标映射和miRNA-mRNA相关性不能确立直接调控效应。
研究结论翻译：总之，跨系统评估识别出一组可重现的CRC相关miRNA改变。5个miRNA——miR-138-5p、miR-30a-3p、miR-30c-2-3p、miR-1271-5p和miR-140-5p——在细胞、EVs和患者组织中表现出一致改变，其中4个改变在TCGA数据集中被独立重现。在该子集中，miR-30a-3p和miR-30c-2-3p的一致降低凸显了跨实验和临床数据集的复发性miR-30家族模式。这些发现表明，跨生物系统评估细胞模型来源的miRNA候选有助于优先筛选可重现的CRC相关改变以供机制研究。
