《International Journal of Molecular Sciences》：A Complex Molecular Profile in Melanoma: Intratumoral Heterogeneity and Therapeutic Implications
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癌症中的复杂分子改变影响肿瘤生物学行为、治疗反应及耐药性。研究人员报告一例皮肤黑色素瘤，显示广泛的瘤内异质性并具有重要临床意义。一名77岁男性ⅡA期皮肤黑色素瘤患者于切除术后1年出现孤立性淋巴结复发。对转移灶行全面二代测序（NGS）揭示罕见的基因组图谱，包括一
癌症中的复杂分子改变影响肿瘤生物学行为、治疗反应及耐药性。研究人员报告一例皮肤黑色素瘤，显示广泛的瘤内异质性并具有重要临床意义。一名77岁男性ⅡA期皮肤黑色素瘤患者于切除术后1年出现孤立性淋巴结复发。对转移灶行全面二代测序（NGS）揭示罕见的基因组图谱，包括一种3类BRAF Y472V突变、两个NF1功能缺失突变以及两个并存的KIT突变：一个占优势的、潜在可靶向的K642E突变和一个低频的、与酪氨酸激酶抑制剂（TKI）耐药相关的D816V突变。该肿瘤表现为高肿瘤突变负荷（TMB）及微卫星稳定。患者接受新辅助纳武利尤单抗（nivolumab）联合瑞拉利单抗（relatlimab）治疗后行手术切除，获得病理学完全缓解。对切除标本重复测序显示所有先前检测到的变异均实现完全分子学清除。本病例说明全面基因组图谱（CGP）在揭示具有共存驱动性与耐药相关改变的生物学复杂黑色素瘤方面的价值。治疗初治即存在的KIT耐药突变提示预存的亚克隆异质性可能影响未来靶向治疗，而高TMB与NF1缺失可能促成了对免疫检查点阻断（ICB）的优异反应。
研究背景：黑色素瘤主要起源于表皮基底层受紫外线损伤的黑细胞。受体酪氨酸激酶（RTK）-丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路的组成性激活是黑色素瘤发生与进展的基础。该通路关键组分包括上游RTK（KIT）、信号转导子（RAS与RAF）及负调节因子（NF1），在黑色素瘤中频繁突变，导致MEK-ERK持续激活，驱动肿瘤细胞失控存活与增殖。癌症基因组图谱（TCGA）依据主导驱动突变将皮肤黑色素瘤分为四类基因组亚型：BRAF突变型、RAS突变型、NF1突变型及三阴性野生型。BRAF突变见于约40–50%的皮肤黑色素瘤，依据激酶活性、二聚化状态及对上游RAS活性依赖程度分为3类；1类（V600E/K/M）以活性单体形式高激酶活性信号，对BRAF联合MEK抑制高度敏感；2类为非V600激活性突变，以二聚体形式RAS非依赖性地驱动MAPK信号，对单体选择性BRAF抑制剂基本无效；3类为激酶受损或激酶失活突变，需上游RAS激活下游MAPK通路，作为信号"放大器"发挥作用，临床上对BRAF抑制剂单药及MEK抑制剂单药反应有限。NRAS突变见于约15–25%的患者，约80–90%位于第61位密码子，可同时激活MAPK与PI3K/AKT通路，与BRAF强激活突变基本互斥。NF1突变见于约10–18%的黑色素瘤，常呈双等位基因失活，功能缺失使RAS持续处于GTP结合活性状态；NF1突变型黑色素瘤对MEK或PI3K抑制剂反应不一致，但常伴高TMB，且通过RAS非依赖、NF-kappaB依赖机制上调PD-L1，因而对抗PD-1免疫检查点抑制剂反应良好；NF1缺失可与BRAF改变共存，尤其是非V600的2类和3类变异。KIT突变在四基因中最少见，占7–15%，主要位于外显子11、13和17，外显子11约占70%（L576P为最常见热点），外显子13约占10–15%（K642E最常见），KIT突变与BRAF V600严格互斥，KIT酪氨酸激酶抑制剂尚未获FDA批准用于黑色素瘤，伊马替尼在Ⅱ期临床试验中客观缓解率（ORR）为20–30%，中位无进展生存约3–4个月。研究人员报告一例皮肤黑色素瘤，罕见地共存3类BRAF突变、两个NF1功能缺失突变及双KIT突变（含一个初治即存在的TKI耐药变异），凸显瘤内异质性的临床意义。目前存在的问题是：常规分子检测往往聚焦于单一主导驱动基因，对低频耐药亚克隆及共存驱动/耐药改变的识别不足，可能影响靶向治疗选择与疗效持久性；治疗初治肿瘤中预存耐药亚克隆对后续治疗的影响尚缺乏报道。
研究人员开展的研究与结论：报告一例77岁男性ⅡA期（T3a，N0，M0）左耳后皮肤黑色素瘤（浅表扩散型，浸润深度2.6 mm，6个真皮核分裂/mm2），既往有基底细胞癌与鳞状细胞癌病史及显著终生日光暴露史。初诊后1个月行前哨淋巴结活检（SLNB）阴性，依患者意愿行Mohs显微描记手术，切缘阴性。术后1年出现左面颈部肿物，颈部增强CT示左2A区19 mm×16 mm低密度异常淋巴结，超声示囊性、低回声、乏血供淋巴结14 mm×10 mm×14 mm3；细针活检示坏死组织伴噬黑素细胞及黑色素沉积，免疫组化MART-1与HMB-45阳性，提示转移性黑色素瘤；分期PET CT证实左下面部软组织FDG高摄取（SUV 6.5，纵隔血池SUV 2.3），无其他转移灶，脑MRI阴性，临床分期ⅢB（rT3a N1 M0），并对淋巴结活检组织行NGS。按Ⅲ期黑色素瘤标准治疗推荐新辅助免疫治疗，患者接受两剂（间隔4周）固定剂量纳武利尤单抗（抗PD-1）联合瑞拉利单抗（抗LAG-3），随后手术切除（参照Ⅱ期临床试验NCT02519322方案），选择该方案而非伊匹木单抗联合纳武利尤单抗以减少治疗相关毒性。新辅助治疗期间无显著毒性。治疗后行左腮腺尾切除（含7枚淋巴结及周围唾液腺组织），组织病理学示病理学完全缓解：2枚淋巴结示治疗相关组织细胞性炎症与轻度纤维化，另5枚淋巴结无恶性细胞，1个腮腺周围软组织结节示组织细胞性炎症，唾液腺实质无肿瘤。据此省略辅助免疫治疗，患者主动监测下无病生存。对手术标本再行NGS，先前于第13个月淋巴结活检中检出的所有分子突变在2%灵敏度阈值下均不可检出，证实病理学与分子学双重完全缓解。结论：初治黑色素瘤中原发KIT K642E驱动突变与亚克隆KIT D816V耐药变异共存此前未见报道；该病例强调全面分子图谱的重要性，不仅在于识别可靶向驱动基因，还在于揭示可能决定治疗持久性与未来治疗临床结局的低频耐药亚克隆。
重要意义：本例表明全面基因组图谱可揭示共存驱动与耐药改变的生物学复杂黑色素瘤；初治即存在的KIT耐药突变提示耐药可源于预存亚克隆多样性而非完全由治疗诱导选择产生；若未来考虑KIT靶向治疗，对占优势的KIT K642E克隆的药理抑制可能促使预存D816V亚克隆选择性扩增，导致治疗逃逸与疾病复发；而高TMB与NF1缺失可能促成了对免疫检查点阻断的优异反应。
关键技术方法（不超过250字）：对淋巴结活检组织及 matched正常外周血行靶向NGS，采用QIAseq Targeted DNA Human Comprehensive Cancer Panel（输入基因组DNA 60 ng），经酶切片段化、末端修复、加A尾、接头连接引入独特分子标识（UMI），基因特异性引物延伸富集目标区域，文库扩增纯化定量后于Illumina NovaSeq X平台测序（1.5B试剂盒，150 bp双端 reads，每样本最低2千万 reads），FASTQ数据经QIAGEN CLC Genomics Workbench（v21.0.4）处理，变异注释与临床解读采用QIAGEN Clinical Insight（QCI）软件，并对肿瘤与匹配正常组织测序以判定体细胞起源。微卫星不稳定性（MSI）采用Promega MSI Analysis System（v1.2）多重PCR-毛细管电泳片段分析，检测8个微卫星标记（NR-21、BAT-60、BAT-25、BAT-59、BAT-26、BAT-56、MONO-27、BAT-52），≥2个标记不稳定判为MSI-High；TMB按非同义突变数/测序兆碱基计算，≥20判为高。样本队列来源为本例患者的淋巴结活检组织、手术后切除标本及匹配正常组织。忽略了试剂与具体培养、质粒构建等操作步骤。
研究结果：（1）病例描述与初始诊疗：患者初诊为左耳后浅表扩散型黑色素瘤，浸润深度2.6 mm、6个真皮核分裂/mm2，无溃疡、血管侵犯、神经趋向性及卫星灶，临床ⅡA期；SLNB阴性，Mohs手术后切缘阴性，按NCCN指南每3个月随访，当时未行分子检测。通过临床与病理评估得出初始分期及切缘状态结论。（2）淋巴结复发与分子检测：术后1年左面颈部出现肿物，影像学及细针活检免疫组化（MART-1、HMB-45阳性）提示转移性黑色素瘤，分期为ⅢB；对淋巴结活检行NGS，检出3类BRAF Y472V、两个NF1功能缺失（无义）突变及双KIT突变（K642E等位基因频率44.8%，为优势克隆；D816V等位基因频率5.2%，为低频亚克隆），肿瘤为高TMB、微卫星稳定。通过NGS与MSI/TMB检测得出该罕见共存基因组图谱结论。（3）新辅助免疫治疗与病理学反应：患者接受两剂纳武利尤单抗联合瑞拉利单抗后行左腮腺尾切除，组织病理学示病理学完全缓解，无显著治疗毒性，遂省略辅助免疫治疗。通过新辅助治疗后的手术标本组织病理学评估得出病理学完全缓解结论。（4）分子学清除：对切除标本再行NGS，先前所有变异在2%灵敏度阈值下均不可检出，证实分子学完全缓解。通过重复NGS得出病理学与分子学双重完全缓解结论。
讨论部分总结与结论翻译：讨论指出，本病例凸显黑色素瘤的生物学复杂性及全面基因组图谱的价值；患者经新辅助免疫检查点阻断获得病理学与分子学完全缓解，两个NF1功能缺失突变与高TMB可能促成了对免疫治疗的优异反应，该结局与Thielmann等报道一致——该多中心回顾性队列研究评估一线免疫检查点抑制剂治疗反应，NF1突变组（N=266）中位总生存较野生型组（N=432，25.82个月）显著改善且尚未达到，这种特殊敏感性归因于NF1改变恶性肿瘤中常见的高TMB，与本例相同。若干基因组发现值得注意：其一，病灶携带3类BRAF Y472V突变，与经典V600改变不同，3类BRAF变异激酶受损，通过增强的RAS依赖机制驱动MAPK过度激活，并存NF1缺失可通过延长RAS活化进一步放大该通路信号；两个不同的NF1无义突变提示可能双等位基因失活，支持NF1缺失为主要协同驱动因素；NF1缺失与3类BRAF突变共存于皮肤黑色素瘤已被充分认识。其二，本例两个并存KIT突变极不寻常：外显子13的KIT K642E位于激酶结构域I，对TKI敏感，VAF 44.8%，代表肿瘤中最占优势的克隆；外显子17的KIT D816V为低频亚克隆突变（VAF 5.2%），该激活环改变使KIT稳定于活性构象以驱动组成性激酶信号，虽为多种恶性肿瘤中对第一代TKI（如伊马替尼）明确的原发耐药机制，但可能对阿伐替尼（avapritinib）等现代选择性抑制剂保持敏感。其三，在初治肿瘤中检出耐药相关KIT D816V突变尤为值得关注，提示治疗耐药可源于预存亚克隆多样性而非仅由治疗诱导选择产生；若未来考虑KIT靶向治疗，对占优势KIT K642E克隆的药理抑制可能促使预存D816V亚克隆选择性扩增，导致治疗逃逸与疾病复发。结论翻译：初治黑色素瘤中原发KIT K642E驱动突变与亚克隆KIT D816V耐药变异共存此前未见报道；本病例强调全面分子图谱的重要性，不仅在于识别可靶向驱动基因，还在于揭示可能决定治疗持久性与未来治疗临床结局的低频耐药亚克隆。
