《International Journal of Molecular Sciences》：Integrating QTL Mapping and Candidate-Region Association to Investigate Kernel Size and Weight in Sweet Corn
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甜玉米广泛用于鲜食和加工，籽粒大小和粒重是重要的产量相关性状。然而，甜玉米中这些性状的遗传结构仍认识不足。本研究利用SHL01 × SHL03重组自交系(RIL)群体，基于高密度SNP遗传图谱，研究籽粒大小和粒重相关性状的遗传基础。在两个环境及最佳线性无偏估计
甜玉米广泛用于鲜食和加工，籽粒大小和粒重是重要的产量相关性状。然而，甜玉米中这些性状的遗传结构仍认识不足。本研究利用SHL01 × SHL03重组自交系(RIL)群体，基于高密度SNP遗传图谱，研究籽粒大小和粒重相关性状的遗传基础。在两个环境及最佳线性无偏估计值(BLUEs)下进行数量性状位点(QTL)定位，随后开展候选区域关联分析以鉴定候选基因。从两个环境和BLUE数据集的12次检测记录中共鉴定到11个唯一QTL。其中，7个唯一QTL（对应8次检测记录）位于第7号染色体。若干QTL位于已报道的籽粒相关性状位点附近，提示甜玉米与普通玉米之间存在部分共享的遗传基础。候选区域关联分析进一步刻画了主效QTL区域，并突出显示5个潜在候选基因。其中，编码推定钾转运蛋白的Zm00001d020325(HAK23)得到功能注释和现有表达信息的支持，但其单倍型与百粒重(HKW)无显著关联。相比之下，由邻近Zm00001d020323变异定义的单倍型在HKW上存在差异，其中GG单倍型均值最高。由于上述分析在重叠群体中进行，单倍型结果具有探索性。总体而言，这些发现刻画了与甜玉米成熟籽粒性状相关的基因组区域，并鉴定出有待进一步验证的候选基因。
研究背景与问题：甜玉米(Zea mays L.)是全球广泛栽培的重要蔬菜作物，除鲜食外，其加工产品（速冻籽粒、罐头、真空包装果穗、玉米饮料等）需求不断增长，因此提高产量对满足鲜食与加工市场均具有重要意义。产量是受多基因控制且易受环境影响的复杂数量性状，籽粒长度(KL)、籽粒宽度(KW)和百粒重(HKW)是反映籽粒生长与大小决定的重要产量组分性状。已有研究通过不同类型群体和定位方法在普通玉米中鉴定出大量与KL、KW、HKW相关的QTL，但单个QTL解释的表型变异比例(PVE)在不同研究间差异较大，且受遗传背景、群体类型与大小、环境条件及统计方法影响，位点重复性难以保证。此外，标记密度增加并不必然提高双亲群体中QTL定位精度，定位分辨率受群体大小与信息性重组事件数目限制，QTL区间往往较宽，给精细定位和候选基因鉴定带来困难。基于自然群体的关联分析可利用长期进化积累的历史重组，分辨率高于传统连锁定位，但群体结构和亲缘关系会影响结果，连锁不平衡(LD)也影响显著信号的解析。区域关联分析聚焦于连锁定位确定的特定基因组区域，结合连锁定位的检测能力与关联分析的较高分辨率，有助于缩小候选区间。已有研究在普通玉米中应用该策略解析籽粒容重、穗部性状和籽粒比例等性状，但甜玉米相关研究相对有限。由于胚乳突变基因影响碳水化合物代谢和淀粉积累，甜玉米成熟籽粒皱缩不规则，既增加表型评价难度，也使遗传基础解析复杂化。因此，整合连锁定位与区域关联分析以刻画甜玉米籽粒大小和粒重相关位点，有助于细化主效QTL区间并促进候选基因鉴定。
研究开展与结论：研究人员以甜玉米自交系SHL01和SHL03构建的RIL群体为材料，在两个环境(21SH、22SH)中评价KL、KW和HKW，先进行QTL定位，再在选定QTL区间内开展候选区域关联分析，并对候选基因进行单倍型分析。共鉴定到11个唯一QTL，其中第7号染色体集中了7个唯一QTL（8次检测记录），4.8–5.3 Mb区间同时与KL、KW及HKW、KW相关，提示该区域可能影响多个籽粒相关性状。若干QTL与普通玉米已报道位点邻近，提示两者存在部分共享的遗传基础。候选区域关联分析突出5个潜在候选基因，其中Zm00001d020325(HAK23)编码推定高亲和钾转运蛋白，获功能注释与表达信息支持，但其单倍型与HKW无显著关联；邻近基因Zm00001d020323的变异所定义的单倍型间HKW存在显著差异，GG单倍型均值最高。该研究刻画了甜玉米成熟籽粒性状相关基因组区域，为后续功能验证和分子标记辅助育种提供了候选基因与基因组区段。
关键技术方法：以SHL01 × SHL03杂交经单粒传法(SSD)获得的230个F7重组自交系(RIL)群体为材料，在上海庄行试验站2021年(21SH)和2022年(22SH)两个环境种植，采用随机完全区组设计三次重复，自交后每系保留5株，果穗风干至籽粒含水量低于14%后，用SC-G自动考种系统测定KL、KW、总粒数和总粒重并计算HKW。表型统计分析采用QTL IciMapping的AOV模块进行联合方差分析、估算广义遗传力(H2)和BLUEs。基因型分析采用基于靶向测序基因分型(GBTS)技术的玉米10K SNP芯片，经Fastp、BWA-MEM、SAMtools、Picard和FreeBayes流程完成SNP calling，以SHL01参考基因组比对。连锁作图与QTL定位采用QTL IciMapping的Kosambi作图函数和ICIM-ADD方法，LOD阈值由1000次置换检验确定，QTL支持区间采用one-LOD drop标准，并将物理区间由SHL01参考基因组转换为B73 RefGen_v4坐标。候选区域关联分析所用基因型和表型数据来自课题组前期建立的甜糯玉米关联群体，包含159个甜玉米自交系（其中150个具HKW、KL、KW完整表型记录用于三性状关联分析，另9个仅用于HKW单倍型分析），采用PLINK提取区间内SNP，用GEMMA基于线性混合模型(LMM)进行关联检验，并比较区域特异亲缘关系模型与留一染色体(LOCO)亲缘关系模型（含或不含前三个主成分）。LD分析采用LDBlockShow，候选基因表达分析采用公共B73胚与胚乳转录组数据集E-MTAB-4395，单倍型分析采用单因素方差分析和Kruskal–Wallis检验。
研究结果：
2.1 表型分析：亲本SHL01与SHL03在籽粒相关性状上存在差异，RIL群体在两个环境中均表现出广泛表型变异。22SH各性状均值均低于21SH，HKW由14.08 g降至10.44 g，KL由11.77 mm降至10.14 mm，KW由9.12 mm降至7.85 mm；变异系数为6.58%–19.35%，HKW相对变异大于KL和KW；偏度与峰度在?0.43至0.61之间，Q-Q图显示表型分布总体接近正态。方差分析表明基因型和基因型×环境互作对三个性状均有显著影响，广义遗传力为0.53–0.64。Pearson相关分析显示三个性状在两个环境和BLUE中均呈显著正相关，KL与KW相关性最强，HKW与KL、KW分别呈正相关（0.806），提示籽粒较大者粒重往往较高。
2.2 籽粒性状的QTL定位：GBTS基因型分析经质量过滤后保留4199个高质量SNP标记，其中4195个定位到10条玉米染色体，遗传连锁图谱全长1804.11 cM，标记平均间隔0.43 cM，最大间隙14.41 cM，占据1962个不同遗传位置。在21SH、22SH和BLUE数据集中共鉴定到12次QTL检测，对应11个唯一QTL，分布于第2、6、7、10号染色体，包括4个KL QTL、4个KW QTL和3个HKW QTL；qKW7-1在22SH和BLUE中均被检测到且共享同一基因组区间，计为同一QTL。LOD值为3.34–8.62，单个QTL解释4.04%–13.90%的表型变异。21SH检测到3个QTL，其中qKL2-1和qKW2-1分别解释10.78%和8.26%的表型变异；22SH检测到3个QTL，均位于第7号染色体，qKL7-2和qKW7-1分别解释13.90%和13.10%，为本研究主效QTL；基于BLUE鉴定到6个QTL，其中qKW7-2的LOD最高(8.62)，qKL7-3解释13.40%的表型变异。第7号染色体检测记录最多，4.8–5.3 Mb区间在22SH中与KL和KW相关、在BLUE中与HKW和KW相关，提示该区域可能影响多个籽粒相关性状。
2.3 整合QTL定位与候选区域关联分析鉴定候选基因：选取PVE大于10%的5个QTL（qKL2-1、qKL7-2、qKL7-3、qKW7-1、qHKW7-1）开展区域关联分析，其中qKL7-2与qKW7-1物理区间相同，最终形成4个不同基因组区域，分别位于Chr2(1,662,571–1,819,689 bp)、Chr7(4,744,844–4,783,865 bp)、Chr7(3,320,507–3,343,680 bp)和Chr7(106,544,511–106,767,536 bp)，重新筛选原始重测序数据分别获得882、373、346、373和271个高质量SNP标记。以建议阈值筛选SNP–性状关联，5个QTL分析共获得66条建议性关联记录；对2245次SNP–性状检验进行多重检验校正后，49条关联在BH-FDR 0.05阈值下仍显著，但无一通过Bonferroni校正，故这些关联被视为候选基因优先排序的探索性证据。结合建议性关联信号、局部LD模式和基因注释，优先筛选出5个潜在候选基因：qKL2-1区内的Zm00001d001845、qKL7-2区内的Zm00001d018770、qKL7-3区内的Zm00001d018732，以及qHKW7-1区内的Zm00001d020323和Zm00001d020325；qKW7-1虽与qKL7-2共享物理区间，但KW关联分析未发现清晰的候选基因相关LD模式。功能注释显示Zm00001d018732编码含Chaperone DnaJ结构域超家族蛋白，Zm00001d018770编码含GYF结构域蛋白，Zm00001d020325编码高亲和钾转运蛋白(HAK23)，Zm00001d001845和Zm00001d020323注释为功能未知基因。利用150个关联群体材料的82,657个LD剪枝全基因组SNP进行主成分分析(PCA)，PC1、PC2、PC3分别解释8.45%、4.22%和3.28%的遗传变异；比较区域特异亲缘关系模型与含或不含前三个主成分的LOCO亲缘关系模型，两种LOCO模型下经BH-FDR或Bonferroni校正后均无SNP显著，表明区域关联信号对亲缘关系模型设定敏感。
2.4 候选基因在胚和胚乳发育中的表达模式：利用普通玉米自交系B73公开转录组数据(E-MTAB-4395)分析候选基因在不同发育阶段的表达谱。5个候选基因在胚和胚乳中呈现不同的时序表达模式：Zm00001d001845在早期发育阶段胚中表达相对较高，胚乳中表达由早期较高降至后期较低；Zm00001d018732在胚中持续高表达并在发育后期维持较高水平，胚乳中表达总体较低；Zm00001d018770在胚和胚乳中均表现发育变异；Zm00001d020325在胚中早期较高、中期下降、随后回升，胚乳中亦随发育阶段变化；Zm00001d020323仅在15个检测胚阶段中的7个呈极低表达(FPKM = 0.1–0.4)，其余8个胚阶段和全部17个胚乳阶段无可用表达值。总体而言，现有转录组数据显示4个候选基因在B73胚和胚乳中呈发育变异表达，但Zm00001d020323表达数据有限，无法可靠评估其发育表达模式；这些结果仅为候选基因在籽粒发育过程中的表达提供补充信息，并未直接证明其在甜玉米中调控籽粒大小或粒重的作用。
2.5 单倍型分析及有利单倍型鉴定：基于功能注释和现有转录组信息，选取Zm00001d020325(HAK23)进行单倍型分析，但该基因在当前群体中与HKW无显著关联。鉴于其与Zm00001d020323位置邻近，将单倍型分析扩展至该邻近基因。在Zm00001d020323及其侧翼2 kb区域共鉴定到23个多态性标记，其中3个标记经Bonferroni校正后与HKW显著关联；比较不同基因型类别间表型差异后，选取7:106546133 G>A和7:106546304 G>C两个SNP用于单倍型构建。这两个多态位点定义GG、GC和AC三种主要单倍型，三种单倍型间HKW差异显著（单因素方差分析F = 9.45，p = 1.33 × 10?4；Kruskal–Wallis检验H = 20.59，p = 3.37 × 10?5）。GG单倍型平均HKW最高(13.64 ± 3.15)，显著高于GC(11.84 ± 2.54)和AC(10.17 ± 1.93)，GC与AC间无显著差异，提示GG单倍型与较高HKW相关，可能是粒重改良的有利单倍型。但由于用于构建单倍型的SNP是基于 largely overlapping 群体中的表型关联筛选的，这些结果应视为探索性而非对Zm00001d020323的独立验证。
讨论与结论：整合QTL定位、候选区域关联分析、转录组表达谱和单倍型分析，可为候选基因优先排序和解析甜玉米籽粒相关性状遗传基础提供互补证据。甜玉米因胚乳糖代谢和淀粉积累差异，籽粒发育与普通玉米不同，其籽粒相关性状遗传调控认识不足。本研究所鉴定QTL的PVE估计可能因在同一群体中进行检测和效应估计而偏高，需在独立群体中进一步评估；第7号染色体上QTL集中分布提示该染色体可能含甜玉米籽粒相关性状的重要基因组区域，重叠区间内的QTL可能反映多效性或紧密连锁位点，但当前定位分辨率无法区分。与已报道位点比较，qKL2-1与SG5/SG7来源F2群体多环境QTL定位研究所鉴定的区域对应且本研究区间更窄，qKW2-1亦位于既往报道的同一染色体区域，qHKW7-1落在此前用SSR标记鉴定的大约100 cM QTL区间内，qHKW10-1与已报道百粒重QTL区域对应，提示尽管遗传背景和籽粒特性不同，甜玉米与普通玉米间可能存在部分共享的籽粒大小和粒重相关基因组区域；部分QTL与既往位点不完全重叠，可能源于遗传背景、分离等位基因、环境条件和定位分辨率差异，也可能与两者籽粒发育和成分差异有关，不完全重叠并不必然意味着不同的遗传位点。环境方面，两年同地试验的性状均值差异可能受季节生长条件变化影响，但现有数据无法确定单个环境因素的贡献；qKW7-1在22SH和BLUE中检测到而21SH未检测到，鉴于KW存在显著基因型×环境互作，这可能反映遗传效应在不同年份间的变化，但亦不能排除统计功效差异，且未正式评价QTL×环境互作，各位点环境稳定性仍不确定。候选基因方面，Zm00001d020325(HAK23)编码HAK/KUP/KT家族推定高亲和钾转运蛋白，既往研究报道其在发育中的胚和胚乳表达，一项多位点GWAS报道相应位点与穗长一般配合力(GCA)相关，但并未直接证明HAK23在籽粒大小或粒重中的作用；Zm00001d020323表达水平极低且可用数据有限，转录组数据对其支持有限，其与粒重的潜在关联主要依据区域关联和探索性单倍型分析。单倍型分析为区域提供了进一步遗传证据，但未能在本群体中建立HAK23单倍型与HKW的直接关联；相反，邻近基因Zm00001d020323内或附近两个多态位点定义的三种主要单倍型间HKW差异显著，GG单倍型均值最高，支持该区域遗传变异与粒重相关，但致变异位点及基因仍未明确。此外，原始区域特异亲缘关系模型下经BH-FDR校正仍有49条SNP–性状关联显著，而LOCO模型下无一显著，凸显区域关联信号对亲缘关系模型设定的敏感性，对优先候选基因需谨慎解读，尚需进一步精细定位和功能验证确定QTL效应背后的基因和变异。研究所鉴定的QTL区域和候选基因可为甜玉米遗传研究和分子标记辅助育种提供潜在靶点，也为进一步研究籽粒发育调控网络提供切入点；未来需结合基因表达分析、遗传转化和基因编辑验证候选基因生物学功能，从而为甜玉米分子育种提供理论依据和标记资源。
结论翻译：本研究采用整合遗传与基因组学的方法，研究甜玉米籽粒大小和粒重相关性状的遗传基础。所鉴定QTL揭示了HKW、KL和KW的丰富遗传变异，第7号染色体成为含有多个籽粒相关性状位点的重要基因组区域。候选区域关联分析进一步刻画了所选QTL区域，并突出显示若干与籽粒相关性状相关的潜在候选基因。其中，Zm00001d020325基于其功能注释和现有表达证据仍为潜在候选基因。对邻近Zm00001d020323的单倍型分析揭示了不同单倍型组间HKW的差异，但这些发现仍具探索性，需要进一步验证。总体而言，这些结果有助于更好地理解甜玉米籽粒相关性状的遗传结构，并为未来功能验证和遗传改良提供候选基因和基因组区域。
