《International Journal of Molecular Sciences》：Chronic Exposure to Flavored Tobacco Aerosols Induces Inflammation and Hepatic Mitochondrial Impairment in Pregnant Versus Non-Pregnant Mouse Cohorts
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本研究旨在探讨弗吉尼亚烟草（Virginia tobacco, VT）、薄荷醇（Menthol, MT）及假烟雾（sham）气溶胶对怀孕与非怀孕小鼠正常及病理反应的影响。研究人员对怀孕与非怀孕队列进行气溶胶雾化暴露及体重分析，并与各组的假烟雾暴露对照组进行比较
本研究旨在探讨弗吉尼亚烟草（Virginia tobacco, VT）、薄荷醇（Menthol, MT）及假烟雾（sham）气溶胶对怀孕与非怀孕小鼠正常及病理反应的影响。研究人员对怀孕与非怀孕队列进行气溶胶雾化暴露及体重分析，并与各组的假烟雾暴露对照组进行比较。通过支气管肺泡灌洗液（Bronchoalveolar Lavage Fluid, BALF）总细胞计数、总蛋白及乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase, LDH）活性评估肺部炎症。此外，采用RT-qPCR及蛋白质印迹法（Western blot）检测肝脏甘油三酯水平及脂肪生成基因，如Scd1、Fasn、Srebp1c1及雌激素受体（estrogen receptor, Esr1）。通过组织病理学及线粒体功能测定评估肝纤维化，并测量各组血清细胞因子。在暴露于VT的怀孕小鼠中，与非怀孕小鼠相比，观察到肺部炎症、细胞计数及蛋白含量增加，而BALF中LDH活性无变化。VT暴露似乎导致直接的不良健康后果，表现为肝脏脂肪生成基因（如Scd1、Fasn、Srebp1c）及雌激素受体表达升高。VT暴露破坏了母体肝脏脂质平衡。雾化吸入VT或MT均显著降低了怀孕小鼠（而非非怀孕小鼠）肝脏的线粒体氧化功能。本研究发现表明，怀孕可能与对VT及MT暴露产生不同的免疫反应有关。VT暴露与肝脏脂肪生成基因改变相关，提示其对母体肝脏存在潜在代谢效应，而MT暴露则与肝脏结构改变及纤维化相关结局有关。
研究背景与目的
过去二十年，电子尼古丁递送系统（ENDS）及电子香烟（eCigs）的使用在全球呈指数级增长。公众普遍认为其完全无害或比传统可燃烟草更安全，这是促使其广泛使用的重要动机。然而，大量研究表明，eCig产生的气溶胶并非单纯的水蒸气，其中包含载体溶剂（丙二醇PG和植物甘油VG）、尼古丁、调味化学物质、多种重金属（如镍、锡、铅、铬、镉）以及其他化学物（如甲醛、乙醛、丙烯醛等）。因此，eCig使用可能诱导尼古丁成瘾及一系列不良生物学与健康后果，包括氧化应激、炎症、组织损伤、激素失衡及神经元功能障碍。肺部是eCig气溶胶的主要进入端口，因此面临最大的有害及潜在有害成分（HPHCs）暴露风险。尽管已有研究证实众多eCig的健康效应与毒性，但特定口味（如弗吉尼亚烟草VT）产品的病理生理后果，尤其是在孕期的影响，尚未得到充分研究。
怀孕期间会发生强烈的免疫、代谢及激素变化以保护发育中的胎儿并维持母体健康。吸烟会负面影响胎儿大脑发育。在妊娠期，母体肝脏的代谢重编程常改变脂肪生成途径以确保营养物质输送至胎儿胎盘单位。然而，孕期特异性变异如何应对来自eCig气溶胶的外源性应激，其机制尚不明确。此前从未系统评估过VT与薄荷醇（MT）气溶胶对怀孕与非怀孕女性肺部炎症、肝脏从头脂肪生成及线粒体功能的差异影响。因此，本研究旨在探究VT与MT调味JUUL产品，以确定口味配方的差异是否会影响长期暴露后小鼠的炎症反应与肝脏线粒体功能，并阐明怀孕特异性因素（如胎儿胎盘单位或激素谱变化）在加重或减轻雾化诱导毒性中的作用。
主要关键技术方法
研究人员采用C57BL/6J雌性小鼠，通过口鼻吸入系统进行为期13周的慢性暴露（含交配前暴露及持续至妊娠第12天的暴露），暴露参数包括36.4 mL/次抽吸、3次抽吸/分钟、16秒间隔。通过支气管肺泡灌洗液（BALF）的总细胞计数、总蛋白及乳酸脱氢酶（LDH）活性评估肺部炎症。利用氯仿-甲醇提取法及比色法测定肝脏甘油三酯。采用RT-qPCR检测肝脏脂肪生成基因（Scd1、Fasn、Srebp1c）及雌激素受体（Esr1）的mRNA水平，并使用蛋白质印迹法（Western blot）分析相应蛋白表达。对非怀孕小鼠肝脏进行苏木精-伊红（H&E）、Masson三色及天狼星红染色以评估组织病理学与纤维化。使用多重微珠免疫分析法（Luminex平台）检测血清中促炎与抗炎细胞因子。利用Oroboros O2k荧光呼吸仪评估肝脏线粒体氧化功能。同时测定血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）和天冬氨酸氨基转移酶（AST）作为肝损伤标志物。
研究结果
2.1 气溶胶暴露影响妊娠期体重变化
研究人员监测了假烟雾、VT及MT组小鼠交配前13周的体重。结果显示，后续怀孕的动物在交配前通常表现出比未怀孕动物更大的体重增长，且在VT和MT暴露组中这种差异更为明显。
2.2 VT诱导怀孕队列血管通透性，而MT引发非怀孕队列促炎浸润
在BALF分析中，VT处理的怀孕组显示总细胞数、总BAL细胞计数及每只小鼠总细胞数轻微升高，伴随总蛋白浓度升高，但LDH浓度略低。而在非怀孕动物中，MT暴露组相较于VT和假烟雾组，显示出更高的总细胞数、总蛋白含量及LDH水平。这表明VT和MT分别通过不同通路在怀孕与非怀孕状态下诱导炎症。
2.3 薄荷醇气溶胶暴露改变怀孕与非怀孕小鼠肝脏甘油三酯及脂肪生成基因表达
在怀孕组中，MT处理队列的肝脏甘油三酯折叠差异最高。在非怀孕组中，VT组呈现甘油三酯升高的趋势。VT处理的怀孕组中，Scd1和Fasn的mRNA水平上调。非怀孕雌鼠在所有处理组中均显示较高的基线Scd1 mRNA水平，而Srebp1c也在非怀孕小鼠肝脏中轻微升高。这表明怀孕显著影响肝脏脂质代谢，而VT暴露可扰乱这一代谢重组。
2.4 怀孕影响SREBP1下调及雌激素受体α蛋白水平改变
蛋白质印迹分析显示，非怀孕假烟雾组的雌激素受体α（ERα）水平显著高于非怀孕VT和MT组；而在怀孕期间，VT和MT处理组的ERα略高于怀孕假烟雾组。SREBP1蛋白在MT非怀孕组中较高，但在怀孕处理组中变化可忽略不计，表明怀孕期间SREBP1通路显著下调。FASN蛋白在VT处理的怀孕组中更高，而SCD1在VT处理的非怀孕组中上调最显著。这证实了VT暴露通过改变脂肪生成基因破坏母体肝脏稳态。
2.5 薄荷醇气溶胶暴露诱导非怀孕队列肝纤维化并决定器官结构完整性
对非怀孕队列的肝脏组织病理学评估（H&E、Masson三色及天狼星红染色）显示，MT处理组表现出更显著的肝纤维化，定量分析进一步确认了这一发现。
2.6 VT气溶胶暴露在怀孕与非怀孕小鼠肝脏中差异性启动靶向炎症转变并加剧免疫反应
在非怀孕队列中，慢性VT暴露导致抗炎细胞因子IL-10显著增加约3倍，而促炎IL-17a及其他标志物变化不显著。在怀孕队列中，VT暴露同时激活了促炎IL-17A和抗炎IL-10，且两者均达到统计学显著性，其他细胞因子呈上升趋势但不显著。这表明孕期独特的免疫冲突导致了靶向性而非泛化的炎症反应。
2.7 怀孕加剧VT和MT刺激引起的肝脏线粒体功能障碍及底物减少
在非怀孕小鼠肝脏中，各处理组在线粒体偶联呼吸（谷氨酸/苹果酸+ADP、棕榈酰肉碱、琥珀酸）方面无显著差异。然而，在怀孕小鼠肝脏中，VT和MT暴露均显著降低了上述所有底物的呼吸速率。这表明雾化吸入VT或MT仅在怀孕状态下显著降低肝脏线粒体氧化功能。
2.8 VT和MT暴露对非怀孕与怀孕小鼠肝脏损伤标志物的影响
血清ALT和AST水平在各处理组间（无论是怀孕还是非怀孕状态）均无统计学显著差异，表明本研究的暴露剂量和时长主要引起肺部损伤和炎症，而未显著改变肝细胞损伤标志物。
讨论与结论总结
本研究表明，慢性暴露于VT和MT气溶胶会导致差异性的生物学反应，具体取决于动物的怀孕状态。VT暴露在孕期引发肺部炎症，而MT暴露则在非孕期导致更强的肺部炎症，提示两者通过不同机制发挥作用。研究还发现，雾化行为扰乱了孕期的肝脏代谢平衡，VT暴露增加了脂肪生成基因表达，而MT暴露则与肝脏甘油三酯积累及纤维化相关。在全身炎症方面，VT暴露在孕期同时激活了促炎（IL-17A）和抗炎（IL-10）细胞因子，暗示孕期发生了复杂的免疫重编程以耐受暴露。最关键的是，VT和MT暴露均在怀孕小鼠中显著降低了肝脏线粒体氧化功能，这可能通过增加活性氧（ROS）生成、促进脂质沉积进而触发炎症和组织结构改变。
研究结论指出，该研究比较了怀孕与非怀孕雌性小鼠暴露于VT和MT电子烟后的效应。结果显示，VT暴露在孕期改变了肝脏脂肪生成基因；在非怀孕小鼠中，VT引起更明显的细胞因子异常，而MT暴露小鼠的组织学染色显示肝纤维化加重。VT和MT暴露均降低了孕鼠的肝脏线粒体功能。更重要的是，该研究强调了怀孕小鼠在孕期可能发生复杂的免疫重编程以耐受雾化暴露，而未见明显的过度炎症证据。由于多数发现属于亚临床水平，这些结果的健康意义和转化价值尚不明确。未来需更多研究验证这些结果能否在人类患者中复现，并阐明雾化暴露与潜在长期肝损伤之间的关联机制。
