《CyTA - Journal of Food》：Time-resolved microbial and physicochemical profiles of wild nuruk-based makgeolli during fermentation and refrigerated storage
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以糯米和野生酒曲（wild nuruk，一种含天然微生物的传统韩国发酵起始剂）为原料，采用单阶段丹阳酒（danyangju）工艺制备米酒（makgeolli）。在11 d发酵及4 d冷藏期间测定理化性质、微生物计数及微生物群落。酒精含量从第5天的0.23 ±
以糯米和野生酒曲（wild nuruk，一种含天然微生物的传统韩国发酵起始剂）为原料，采用单阶段丹阳酒（danyangju）工艺制备米酒（makgeolli）。在11 d发酵及4 d冷藏期间测定理化性质、微生物计数及微生物群落。酒精含量从第5天的0.23 ± 0.06%升至第11天的12.40 ± 0.00%，白利度（Brix）从第3天的35.67 ± 0.29%降至第11天的20.83 ± 0.15%；pH在3.83 ± 0.06至4.27 ± 0.06之间波动。Saccharomycopsis fibuligera在第5天占优势（84.33%），而Saccharomyces cerevisiae在第7天占优势（62.26%）。Companilactobacillus自酒曲中的45.77%下降，而Weissella至第11天成为优势菌（43.02%）。冷藏期间，pH由3.83 ± 0.06升至4.23 ± 0.06，而白利度与酒精含量保持稳定。上述结果揭示了动态的微生物演替，并强调了对微生物组进行监测以保证品质一致性与安全性的必要性。
研究背景与问题 米酒（makgeolli）是以蒸煮大米、水与酒曲（nuruk，由谷物制成并经环境微生物自然富集的发酵起始剂）发酵而成的传统韩国米酒。野生酒曲（wild nuruk）未经特定微生物接种，其所含微生物来自当地环境，赋予传统米酒独特的感官与发酵特征，这些本土微生物在糖化、酸化、酒精生成及风味形成中发挥关键作用。已有研究揭示了酵母、丝状真菌与乳酸菌（LAB）随时间的动态演替，但由于野生酒曲为自然形成的发酵基质，其微生物组成在不同批次与酿造环境间差异显著，导致发酵结果与产品品质难以预测。米酒因活跃的微生物生态系统而持续发生生化与微生物变化，通常需冷藏以减缓微生物活性并延长货架期。近年来，精准发酵与数据驱动建模受到关注，机器学习或深度学习技术依赖特征明确、时间分辨且公开可获取的微生物数据集构建稳健预测算法；然而现有研究的数据集往往碎片化或未公开，尤其缺乏同时涵盖酒曲（接种物）与发酵饮料的原始微生物测序数据，阻碍了跨研究比较与预测建模。为此，研究人员按传统丹阳酒（danyangju，单阶段发酵工艺）方法在实验室制备米酒，以受控条件监测发酵及冷藏全过程的化学与微生物变化，主要目标是提供一份开放可获取的数据集，描述米酒生产与贮藏各阶段动态微生物群落及理化参数，并将微生物组数据存入开放获取数据库，以支持韩国米酒研究及数据驱动发酵科学的发展。
关键技术方法 研究以500 g糯米、500 mL市售瓶装饮用水与100 g野生酒曲（韩国釜山Sanseong Nuruk）为原料，糯米浸泡3 h后蒸煮1 h，于洁净台内与酒曲和水混合，装入1.9 L消毒玻璃瓶，23 °C发酵11 d；前3 d维持好氧并每日搅拌一次，第3天后密封。设4个平行发酵容器，分别对应第3、5、7、11天取样，避免重复取样改变发酵体积；酒曲作为初始微生物参考（视为第0天）。第7天开始4 °C冷藏4 d。理化指标pH、白利度（Brix）与酒精含量（%）均做技术三重复，酒精采用蒸馏–比重计法测定。微生物计数采用梯度稀释平板计数，马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）25 °C培养5 d计数酵母与霉菌，de Man–Rogosa–Sharpe（MRS）琼脂36 °C培养48 h计数推定乳酸菌，结果以log CFU/mL表示。微生物组分析提取基因组DNA，扩增16S rRNA基因V3–V4区（细菌）与ITS1区（真菌），Illumina Nextseq2000平台300 bp双端测序，目标深度>100,000 reads/样本；采用QIIME 2（2024.5版）分析，DADA2去噪生成扩增子序列变体（ASVs），细菌比对SILVA 138.1数据库，真菌经ITSxpress修剪后比对UNITE 10数据库；α多样性以Faith系统发育多样性（Faith PD）、观测特征数与Shannon指数评估，细菌与真菌特征表分别抽平至150,000与140,000条序列。统计分析采用GraphPad Prism 11.1.0，发酵各天指标行单因素方差分析（ANOVA）及Tukey诚实显著性差异（HSD）检验，冷藏前后行双尾t检验，p < 0.05为显著。
研究结果
3.1 发酵期间米酒理化与微生物特征变化 发酵中蒸煮米逐渐崩解、酒醪浑浊度增加。pH在各发酵天间差异显著（单因素ANOVA，p < 0.0001），第3、5、7、11天分别为3.87 ± 0.06、4.27 ± 0.06、3.83 ± 0.06与4.10 ± 0.00，除第3天与第7天外各两两比较均显著。白利度差异显著（p < 0.0001），由第3天35.67 ± 0.29%略升至第5天36.23 ± 0.15%，随后显著降至第7天24.23 ± 0.15%与第11天20.83 ± 0.15%，各时段两两比较均显著。酒精含量随发酵时间显著增加（p < 0.0001），第3天未检出，第5天为0.23 ± 0.06%，第7天与第11天分别达7.80 ± 0.00%与12.40 ± 0.00%，各两两比较均显著。PDA平板计数由第3天8.73 log CFU/mL降至第5天8.54、第7天7.95与第11天7.55 log CFU/mL，MRS平板计数由8.79降至8.66、8.00与7.28 log CFU/mL，因来自单一发酵批次且技术重复有限，仅作描述性呈现。
3.2 发酵期间微生物组分析结果 细菌方面，门水平Firmicutes各时间点均占优势，Proteobacteria发酵中增加并于第7天达最高；纲水平Bacilli与Gammaproteobacteria为主要类群，后者自第3天至第7天渐增；目与科水平分别为Lactobacillales与Enterobacterales、Lactobacillaceae与Enterobacteriaceae，Enterobacterales与Enterobacteriaceae在第7天相对频率最高，分别达53.86%与53.81%。属水平Companilactobacillus在酒曲中最高（45.77%），发酵启动后下降至第3、5、7、11天的1.33%、0.58%、0.87%与0.67%；Kosakonia发酵中增加，第7天约53.70%，第11天降至约27.79%；Weissella自第3天起增加，第5天与第7天约37.10%与29.27%，第11天升至约43.02%；Pediococcus在酒曲中几乎未检出，发酵中增加至第7天约12.54%与第11天约23.57%。真菌方面，门、纲、目水平Ascomycota、Saccharomycetes、Saccharomycetales全程占90%以上，Mucoromycota、Mucoromycetes、Mucorales以低频率检出；科水平Saccharomycopsidaceae自酒曲至第5天占优势，Saccharomycetaceae自第7天增加并于第11天成为主要科；属水平Saccharomycopsis在酒曲中占优势并延续至第5天，第7天后下降，Saccharomyces于第7与11天增加，Mucor低频率检出并于第11天降至0.42%；种水平Saccharomycopsis fibuligera自酒曲至第5天占优势，分别约65.37%、89.32%与84.33%，第7与11天降至约33.42%与24.41%，Saccharomyces cerevisiae自酒曲至第5天低频率，第7与11天升至约62.26%与73.72%，Mucor circinelloides全程低频率，Pichia kudriavzevii在酒曲中约24.97%，第3天后降至4%以下。发酵过程中16S rRNA基因与ITS区微生物多样性动态变化。
3.3 冷藏后米酒特征变化 pH由第0天3.83 ± 0.06显著升至第4天4.23 ± 0.06（双尾t检验，p = 0.0278）；白利度无显著差异（p = 0.4226），分别为24.23 ± 0.15%与24.83 ± 0.15%；酒精含量两点均为7.8 ± 0.0%，无变化。PDA计数由第0天7.95降至第4天7.83 log CFU/mL，MRS计数由8.00降至7.67 log CFU/mL。冷藏前后Firmicutes、Bacilli、Lactobacillales与Lactobacillaceae增加，Proteobacteria、Gammaproteobacteria、Enterobacterales与Enterobacteriaceae减少；属水平Weissella冷藏前占优势（约29.27%），冷藏后降至约20.39%，Pediococcus由约12.54%升至约28.92%，Kosakonia由约53.70%降至约47.49%。真菌门、纲、目水平Ascomycota、Saccharomycetes、Saccharomycetales仍占优势且变化微小；科、属、种水平Saccharomycopsidaceae、Saccharomycopsis与Saccharomycopsis fibuligera由第0天约33%降至第4天约18%，Saccharomycetaceae、Saccharomyces与Saccharomyces cerevisiae由约62%升至约80%，Pichia/Pichia kudriavzevii与Mucor/Mucor circinelloides两点均低频率检出。冷藏4 d期间细菌与真菌α多样性仅轻微变化：细菌Faith PD与Shannon指数略降，观测特征数基本不变；真菌Faith PD、观测特征数与Shannon指数均下降。
讨论与结论 讨论指出，本研究对单批次野生酒曲米酒传统单阶段丹阳酒工艺的理化与微生物变化作了时间分辨描述，所观察的微生物演替与既往报道总体一致，提示该单批次轨迹可能反映野生酒曲米酒发酵的一般趋势，但其跨工艺普适性仍需进一步验证。pH、白利度与酒精含量等主要化学参数与微生物动态呈明显关联，Saccharomycopsis fibuligera减少与Saccharomyces cerevisiae增加的趋势与先前研究一致，白利度下降与酒精上升反映两种酵母间的代谢交接；即便使用未控制接种的野生酒曲，演替模式仍与其他酒曲发酵米酒基本一致。低频率检出的Mucor在发酵食品体系中具淀粉酶活性，可能参与淀粉水解为可发酵糖，为酵母提供底物。细菌中Weissella与Pediococcus两类乳酸菌在发酵与贮藏全程均为关键组分，已知可塑造米酒酸度与风味；Kosakonia在发酵中期突出，第5至7天急增，其在酒曲中低水平存在与小麦、水稻相关，说明该菌群可能源自原料而非人为接种，符合开放非接种发酵体系特征，此模式与米酒发酵中Kosakonia存在且丰度与酒精生成相关的报道一致，该属亦在传统中国黄酒红曲中检出，提示其可能在多种米基发酵中发挥保守作用；其具体功能尚不明确，可能参与酒精相关氧化还原过程或与酵母群落代谢互作，并与固态发酵中Kosakonia与挥发性有机化合物及游离氨基酸显著正相关的研究相符，未来结合风味化合物分析将有助于阐明其作用；其冷藏后仍持续存在提示具一定低温耐受性，可能有助于产品稳定性。冷藏后理化参数基本稳定，pH略升而酒精含量不变，表明冷藏有效减缓微生物代谢；但微生物结构仍有细微变化，Weissella相对丰度下降而Pediococcus上升，可能反映乳酸菌间耐受性差异；真菌方面Saccharomyces cerevisiae更趋优势而Saccharomycopsis fibuligera继续下降，提示某些酵母在冷藏下仍具代谢活性并可能影响贮藏期风味；Shannon与Faith PD下降表明冷藏降低了整体微生物活性并可能有利于少数更具耐受性的类群。本研究的独特贡献在于对同一生产轨迹中起始物料、发酵阶段米酒与短期冷藏的整合观察，以及细菌与真菌扩增子测序数据集的公开可获取；跨发酵与冷藏的配对理化与微生物组谱为未来多批次验证与传统韩国米酒发酵预测建模提供了时间分辨参考数据集。结论部分译为：本研究采用含野生酒曲的传统单阶段工艺，对米酒发酵及后续冷藏过程中微生物群落动态与理化变化进行了时间分辨表征。通过在受控单批次设计中整合微生物谱与理化测定，本研究提供了一份描述米酒发酵与贮藏、内部一致性良好的参考数据集。所生成的数据集支持跨研究的系统比较，并为传统发酵体系的未来数据驱动研究奠定基础。
