《Biomolecules》：Decoding Human Milk Lactoprotein Heterogeneity: From Genetic Variation to Proteoforms and Peptidoforms in a Comparative Mammalian Context
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人乳蛋白展现出广泛的分子异质性，其来源包括遗传变异、转录多样性、翻译后修饰（PTMs）以及蛋白水解加工。本综述在一个基因组–转录本–蛋白质形态–肽形态框架内整合了关于主要人乳酪蛋白及特定乳清蛋白的证据，并在相关处纳入了比较哺乳动物数据。特别强调了区分预测的分子
人乳蛋白展现出广泛的分子异质性，其来源包括遗传变异、转录多样性、翻译后修饰（PTMs）以及蛋白水解加工。本综述在一个基因组–转录本–蛋白质形态–肽形态框架内整合了关于主要人乳酪蛋白及特定乳清蛋白的证据，并在相关处纳入了比较哺乳动物数据。特别强调了区分预测的分子后果、间接证据支持的关系，以及经实验证实的分子实体与转化。基因组变异与选择性RNA加工提供了初级序列多样性的潜在来源，而磷酸化、糖基化和蛋白水解进一步扩展了蛋白质与肽的异质性。人β-酪蛋白提供了一个特别有启发性的实例，其磷酸化和糖基化定义的蛋白质形态及相应的修饰解析型肽形态已得到实验表征。然而，各分子层面的证据仍不均衡，且在同一个体体内从母体基因型到表达的转录本、分泌的蛋白质形态及下游肽形态的直接追溯仍然有限。通过识别已确立的实验关系与未解决的分子关联，本综述为解读人乳乳蛋白异质性并指导未来整合性蛋白质基因组学研究提供了一个基于证据的框架。
论文主体内容总结
3. 人乳乳蛋白景观：组成与分子异质性
人乳含有复杂且动态的蛋白质组分，其组成随泌乳期和个体差异而变化。蛋白质通常被分类为酪蛋白、乳清蛋白和乳脂肪球膜相关组分，其相对贡献随泌乳阶段而改变。除定量变化外，乳蛋白还表现出由初级序列变异、选择性RNA加工、翻译后修饰（PTMs）和蛋白水解加工引起的分子异质性。
3.1. 人酪蛋白组分
功能性人酪蛋白组分包括αS1-酪蛋白（αS1-CN）、β-酪蛋白（β-CN）和κ-酪蛋白（κ-CN），其中β-CN通常是主要成分。与主要奶用反刍动物不同，人类缺乏已确立的功能性αS2-酪蛋白对应物。人酪蛋白表现出显著的构象灵活性和内在无序性，有利于分子间结合、矿物质相互作用和蛋白水解可及性。人乳和牛乳酪蛋白胶束在组成和物理化学组织上存在差异。
3.1.1. αS1-CN：丰度、结构特征与分子异质性
人αS1-CN是酪蛋白组分中相对次要的成分，表现出相当大的个体间差异。标准人αS1-CN前体包含185个氨基酸，包括一个15残基的信号肽，成熟蛋白为170个残基。与几种反刍动物直系同源物不同，人αS1-CN含有三个半胱氨酸残基，可参与分子间二硫键形成。磷酸化是αS1-CN蛋白质形态异质性的主要来源。
3.1.2. β-CN：丰度、分子结构与异质性
β-CN是主要的人酪蛋白，其报告丰度和泌乳曲线在不同研究中有所差异。标准人β-CN前体包含226个氨基酸，包括一个15残基的信号肽，成熟蛋白为211个残基。磷酸化是β-CN蛋白质形态异质性的主要来源，已实验表征的分子物种含有零至五个磷酸基团，主要位于N端区域。O-糖基化和蛋白水解加工增加了额外的分子多样性，β-CN是人乳内源性肽的重要前体。
3.1.3. αS2-酪蛋白相关位点：缺乏功能性人对应物
与牛、山羊和绵羊乳不同，人乳缺乏已确立的功能性αS2-酪蛋白（αS2-CN）。尽管如此，人酪蛋白基因簇保留了两种进化上相关的位点，即CSN1S2AP和CSN1S2BP，两者均被注释为假基因。迄今为止，尚未有实验证实分泌性人αS2-CN蛋白的存在。
3.1.4. κ-CN：丰度、结构特征与胶束稳定化
人κ-CN在酪蛋白组分中发挥独特的结构作用，有助于钙敏感受损酪蛋白的胶体稳定化。标准人κ-CN前体包含182个氨基酸，包括一个20残基的信号肽，成熟蛋白为162个残基。广泛的O-糖基化是人κ-CN的一个定义性分子特征。κ-CN对胶束稳定性的贡献已通过实验证明。
3.2. 主要乳清蛋白与骨桥蛋白
本综述考虑的主要乳清蛋白包括α-乳白蛋白（α-LA）、乳铁蛋白（LF）、分泌型免疫球蛋白A（sIgA）和溶菌酶（LZ）。与牛乳的一个显著组成区别是人乳乳清蛋白质组中不存在内源性β-乳球蛋白。
3.2.1. α-LA：丰度、分子结构与功能特化
α-LA是一种主要的人乳乳清蛋白，其丰度随泌乳期变化。标准人α-LA前体包含142个氨基酸，包括一个19残基的信号肽，成熟蛋白为123个残基。其紧凑结构含有一个Ca2+结合位点，并由四个分子内二硫键稳定。与酪蛋白和LF相比，α-LA表现出相对有限的经实验表征的蛋白质形态异质性。
3.2.2. LF：丰度、分子结构与异质性
LF是一种铁结合糖蛋白，属于转铁蛋白家族，是人乳抗菌防御的重要组成部分。其浓度通常在泌乳期间下降。标准人LF前体包含710个氨基酸，包括一个19残基的信号肽，成熟蛋白为691个残基。人LF表现出显著的糖基化异质性，主要涉及N-连接聚糖。此外，天然质谱法揭示了不同的脱铁、单铁和二铁LF群体。
3.2.3. sIgA：丰度、分子组装与异质性
sIgA是人乳中主要的免疫球蛋白形式。它是一个多链抗体复合物，包含聚合免疫球蛋白A（IgA）、一个连接链（J链）和分泌成分（SC）。sIgA的分子异质性反映了抗体序列和克隆型多样性、IgA1和IgA2亚类间的差异、寡聚组装以及广泛的糖基化。
3.2.4. LZ：丰度、分子结构与物理分配
LZ是一种小的抗菌酶，其丰度在人泌乳期间有所变化。标准人LZ前体包含148个氨基酸，包括一个18残基的信号肽，成熟蛋白为130个残基。尽管通常被归类为乳清蛋白，LZ也与酪蛋白胶束结合。
3.2.5. OPN：一种高度修饰的蛋白和内源性肽的来源
骨桥蛋白（OPN）是一种内在无序的磷糖蛋白，其特征是广泛的PTMs和对蛋白水解加工的敏感性。OPN参与细胞粘附和整合素介导的相互作用。
3.3. 人乳蛋白质组的泌乳依赖性与个体间重塑
泌乳阶段是人乳蛋白组成的主要决定因素。个体乳蛋白遵循不同的时间模式。这些泌乳依赖性变化伴随着个体间变异性，可能与母体和婴儿特征有关。重要的是，总蛋白丰度的变化不一定与分子形式分布的变化平行。
4. 乳蛋白异质性的基因组起源
基因组变异通过蛋白质编码序列的改变、转录调控和RNA加工，对人乳乳蛋白异质性做出贡献。
4.1. 主要人乳蛋白基因的基因组结构
三个功能性人酪蛋白基因CSN1S1、CSN2和CSN3在4号染色体的分泌性钙结合磷蛋白区域内物理连锁，连同两个αS2-酪蛋白相关假基因。相比之下，LALBA、LTF和LYZ占据独立的基因组位点，而sIgA则由多个基因编码的组件组装而成。
4.1.1. 人酪蛋白基因簇
人酪蛋白基因簇位于染色体4q13.3的SCPP区域内，包含三个功能性酪蛋白基因和两个αS2-酪蛋白相关假基因。这些位点在GRCh38.p14参考组装中跨越约320 kb。五个酪蛋白相关位点并非直接连续，因为其他SCPP基因出现在中间的基因组区域。
4.1.2. 分散的乳清蛋白基因
与物理连锁的酪蛋白基因不同，主要的非免疫球蛋白人乳清蛋白基因占据不同的基因组位点。LALBA位于染色体12q13.11，LTF位于3p21.31，LYZ位于12q15。尽管共享染色体位置，LALBA和LYZ相隔约20.8 Mb。
4.1.3. 人sIgA的多位点基因组结构
与单基因乳蛋白不同，sIgA由多个基因组位点编码的组件组装而成。免疫球蛋白重链位点位于染色体14q32.33。免疫球蛋白轻链来源于2p11.2的κ位点或22q11.22的λ位点。连接链由JCHAIN编码，分泌成分来源于PIGR编码的受体。
4.2. 序列变异与遗传编码的乳蛋白异质性
遗传序列变异可能通过蛋白质编码区、剪接相关序列和顺式调控元件的改变，对人乳乳蛋白异质性做出贡献。
4.2.1. CSN1S1：序列变异与潜在的αS1-CN异质性
人CSN1S1表现出编码序列变异，有可能产生不同的αS1-CN一级结构。选定的错义变异涉及氨基酸电荷、极性和侧链化学性质的改变。
4.2.2. CSN2：人β-CN中的编码变异与多位点
人CSN2内的编码序列变异是β-CN一级结构异质性的潜在来源。选定的错义等位基因涉及影响氨基酸电荷、极性和侧链化学性质的取代。
4.2.3. αS2-CN相关假基因：无已确立分泌蛋白产物的序列变异
与功能性人酪蛋白基因不同，CSN1S2AP和CSN1S2BP被归类为αS2-CN相关假基因。常规的错义变异术语和蛋白质水平后果的预测不适用。
4.2.4. CSN3：编码变异及其对κ-CN分子异质性的潜在影响
人CSN3内的编码序列变异可能通过改变参与蛋白质构象、分子间相互作用或PTMs的氨基酸残基，对κ-CN分子异质性做出贡献。
4.3. 人乳蛋白变异的群体基因组分布与等位基因频率
群体基因组分析揭示，人酪蛋白基因内序列变异的频率和祖先特异性分布存在显著差异。所调查的七个代表性错义等位基因在gnomAD v4.1.2中表现出不同的频率模式。
4.4. 人酪蛋白基因簇中的连锁与等位基因相
功能性人酪蛋白基因在4号染色体上的物理聚集为多位点单倍型提供了基因组框架。物理邻近并不一定意味着强连锁不平衡。
4.5. 乳蛋白基因进化的比较哺乳动物视角
比较基因组研究表明，哺乳动物乳蛋白基因起源于进化上保守的基因家族，随后经历了谱系特异性复制、序列分化、假基因化和功能多样化。
5. 乳蛋白异质性的转录组学起源
泌乳乳腺转录组代表了母体基因组变异与乳蛋白合成之间的中间分子层。转录组异质性源于基因表达水平和RNA加工的差异。
5.1. 精选转录本结构与选择性RNA加工
精选RefSeq注释揭示了人乳蛋白基因转录组变异的三种主要模式：编码改变的转录本多样性、编码保留的RNA变异以及替代性编码转录本的受限代表。
5.2. 泌乳依赖性乳腺转录组重塑
乳腺基因表达在泌乳期间经历实质性重塑，涉及乳蛋白转录和与分泌分化相关的更广泛分子途径的变化。
