《Science Signaling》：Subunit engineering enables the generation of human interleukin-39 as a proinflammatory cytokine
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白细胞介素（interleukins）是控制免疫应答的信号蛋白。因此，界定人源白细胞介素的范围、其相关受体、信号通路及功能对于理解和调控保护性与病理性免疫不可或缺。白细胞介素-39（IL-39）是由IL-23α和EBI3亚基组成的异二聚体，在小鼠中已被描述为促
白细胞介素（interleukins）是控制免疫应答的信号蛋白。因此，界定人源白细胞介素的范围、其相关受体、信号通路及功能对于理解和调控保护性与病理性免疫不可或缺。白细胞介素-39（IL-39）是由IL-23α和EBI3亚基组成的异二聚体，在小鼠中已被描述为促炎细胞因子，但其在人源白细胞介素库中的存在一直存在争议。本研究表明，IL-39在人细胞中难以由IL-23α和EBI3自发形成。通过计算机建模与实验方法相结合，研究人员鉴定了使人IL-23α:EBI3异二聚体不稳定的结构特征。基于这些见解，研究人员对人IL-23α和EBI3进行了理性工程改造，使其形成可由细胞分泌的二硫键连接的异二聚体。该工程化细胞因子在原代人免疫细胞上结合受体亚基IL-23R和gp130，刺激转录调节因子STAT1和STAT3的磷酸化，导致促炎细胞因子分泌。总之，研究结果界定了人IL-39生物合成中的局限性，并表明这些局限可通过分子工程克服。该工作凸显了理性细胞因子工程在生成具有活性的免疫信号蛋白方面的潜力，并为进一步界定IL-39在人免疫中的可能作用奠定了基础。
研究背景方面，白细胞介素是调控免疫细胞功能的分泌型信号蛋白，人源已发现40余种。白细胞介素-12（IL-12）家族是免疫细胞功能的关键调控者及临床治疗靶点，其结构复杂性在于每个经典成员均为α和β亚基组成的异二聚体。三种α亚基（IL-12α/p35、IL-23α/p19、IL-27α/p28）与两种β亚基（IL-12β/p40、EBI3）原则上可组合形成六种异二聚体细胞因子，但人源仅验证了四种：IL-12、IL-23、IL-27和IL-35。其中IL-23α:EBI3异二聚体在人源中的存在仍存争议。小鼠中该异二聚体被命名为IL-39，与促炎功能相关，可能参与免疫防御及炎症性疾病。小鼠IL-39据报通过IL-23R和gp130受体亚基信号传导，诱导STAT1和STAT3磷酸化。由于临床上多种阻断IL-23信号的抗体靶向IL-23α，可能同时作用于IL-39，因此研究人源IL-39的可能性具有重要意义。研究人员开展了人IL-23α与EBI3能否形成IL-39的研究，发现人IL-39不能自发形成，揭示了其分子限制因素，并通过理性工程改造成功生成了具有促炎功能的工程化人IL-39，证明了人免疫细胞完全具备对该细胞因子应答的能力，为理性细胞因子工程调控免疫应答奠定了基础。
在技术方法上，研究人员主要采用了以下关键技术：（1）结构建模与复合物预测，利用MODELLER进行同源建模并结合AlphaFold 2预测突变后复合物结构；（2）共免疫沉淀（co-IP）与免疫印迹，在人胚胎肾（HEK）293T细胞中分析亚基组装与分泌；（3）哺乳动物蛋白表达与纯化，在Expi293F细胞中表达并通过StrepII亲和层析及尺寸排阻色谱（SEC）纯化蛋白；（4）表面等离子共振（SPR）测定受体结合亲和力；（5）多角度光散射（MALS）与动态光散射（DLS）分析蛋白复合物分子量与均一性；（6）原代人外周血单个核细胞（PBMC）分离及磷酸化流式细胞术分析STAT磷酸化；（7）LEGENDplex多因子检测定量细胞因子分泌。人PBMC来源于健康供体。
研究结果方面，第一，人IL-23α与EBI3具有阻止IL-39组装和分泌的结构特征。研究人员在HEK293T细胞中共表达两亚基，co-IP未检测到EBI3与IL-23α的相互作用，而IL-12β可与之形成IL-23；EBI3不能诱导IL-23α分泌，而IL-12β可以。结构建模发现人IL-23α:EBI3界面存在空腔（EBI3 Ala80附近）、EBI3 Phe77的位阻效应、IL-23α His163附近空腔以及IL-23α Cys54未配对等问题。EBI3 Q75C突变可稳定异二聚体但几乎不促进分泌。第二，优化的人IL-23α:EBI3异二聚体可从细胞分泌。研究人员将EBI3Q75C与折叠能力增强的IL-23αstab（C22V/F161C）共表达，实现了异二聚体的共分泌，非还原SDS-PAGE证实形成了共价异二聚体。纯化后经SEC-MALS和DLS验证为均一的约77 kDa复合物。第三，人IL-23α:EBI3异二聚体结合IL-23R和gp130。SPR测定显示工程化异二聚体与IL-23R结合（Kd约865.7 nM），与gp130结合（Kd约5.1 μM），亲和力低于天然IL-23与IL-23R及IL-27与gp130的结合。第四，人IL-39是有功能的促炎细胞因子。在BL-2细胞中，工程化人IL-39（hIL-39eng）诱导STAT1和STAT3磷酸化；guselkumab、抗gp130抗体及ruxolitinib均可阻断其信号传导。在U937细胞中EC50较IL-27高约100倍。第五，人IL-39在原代人免疫细胞中引发促炎应答。B细胞、CD4+ T细胞和CD8+ T细胞均表达IL-23R和gp130，hIL-39eng诱导STAT3磷酸化并可被guselkumab阻断；PBMC经hIL-39eng刺激后分泌IL-2、IL-6、IL-8和干扰素-γ（IFN-γ），该分泌可被guselkumab阻断。
讨论部分总结：本研究提供了关于人IL-39可能存在性的基础性见解。人IL-23α和EBI3可在细胞内组装但无法作为异二聚体细胞因子分泌，原因在于人EBI3无法诱导人IL-23α折叠，而IL-12家族成员分泌的前提是α亚基的组装诱导折叠。这表明人免疫细胞通常无法分泌IL-39，但特定细胞类型中可能存在例外。工程化人IL-39及功能实验体系，结合guselkumab可抑制IL-39的发现，为研究人IL-39是否在特定条件下内源性产生提供了工具。研究还揭示小鼠与人IL-12家族之间存在潜在差异，提醒将小鼠模型见解转化至人时需格外谨慎。靶向IL-23α的抗体可能同时抑制IL-23和IL-39。研究结论翻译如下：总之，本研究建立了一个概念框架，解释了内源性人IL-39分泌明显缺失的原因，同时揭示了其可能形成的条件。此外，该工作进一步强调了IL-12家族介导的免疫应答中的种间差异。研究人员强调，关于小鼠IL-39的证据仍然非常有限，尚无详细的生化表征报道，未来需深入研究以验证小鼠IL-39的存在与功能。独立于此，研究人员成功工程化了具有促炎功能的人IL-39并界定了其受体谱，证明理性细胞因子工程可利用合理设计的配体靶向内源性细胞受体谱来调控免疫应答。
