基于多孔石墨碳柱液相色谱-串联质谱法测定食品中丙烯酰胺

《Molecules》：Determination of Acrylamide in Foods by Liquid Chromatography–Tandem Mass Spectrometry with a Porous Graphitic Carbon Column

　　

建立了一种采用多孔石墨碳（PGC）柱进行分离的高效液相色谱-串联质谱（HPLC–MS/MS）方法，用于测定食品中的丙烯酰胺。样品中加入同位素标记的内标物，用乙腈-水提取，经混合模式阳离子交换（MCX）固相萃取柱净化，然后在PGC柱上进行分离。通过采用单步过柱式MCX净化，评估了PGC柱在复杂基质中的固有抗干扰能力。甲醇和含0.1%甲酸的水作为流动相，检测在正电喷雾电离模式下采用多反应监测（MRM）模式进行。利用肉制品和咖啡样品进行了方法验证，并将该方法进一步应用于八个样品类别（n = 68），包括薯片、饼干、速溶咖啡以及闽南地方特色食品。丙烯酰胺在10–500 μg/L浓度范围内表现出良好的线性关系，相关系数为0.9994–0.9998。检出限（LOD）为0.81–1.38 μg/kg，定量限（LOQ）为2.70–4.61 μg/kg。平均加标回收率为94.2–103.4%，相对标准偏差（RSD）为0.8–5.4%；PGC柱的基质效应为60.6–76.5%，而C18柱为46.8–51.3%。配对t检验表明，PGC柱的基质效应（ME）值显著高于C18柱（即信号抑制更小）（p < 0.05）。由于PGC柱对极性化合物具有很强的保留特性，该方法有效改善了色谱分离效果并减少了共洗脱干扰。它为在干扰可控的基质（如肉制品）中减少基质干扰和提高灵敏度提供了一种实用方法，同时有效克服了在像咖啡这样高度复杂的基质中丙烯酰胺被高估的问题，残余的基质效应由同位素标记的内标物在这些特定验证过的基质中进行校正。

一、研究背景与科学问题

丙烯酰胺是一种小分子有机化合物，主要在富含还原糖和游离天冬酰胺的食品经过高温加工（如油炸、烘烤，通常高于120°C）过程中，通过美拉德反应生成。2002年瑞典国家食品管理局首次报道了热加工马铃薯制品及其他焙烤食品中存在较高含量的丙烯酰胺，引起了全球广泛关注。国际癌症研究机构将其列为2A类致癌物，此外丙烯酰胺还具有神经毒性、免疫毒性和其他有害作用。因此，对食品中丙烯酰胺进行准确定量对于评估暴露水平和健康风险至关重要。欧盟于2017年发布了(EU) 2017/2158法规，为特定食品类别设定了基准水平并要求采取缓解措施。

目前丙烯酰胺的检测主要依赖色谱或质谱技术，其中液相色谱-串联质谱应用最为广泛。然而，由于丙烯酰胺极性极强、水溶性极高，在传统C₁₈反相色谱柱上保留很弱，容易与样品基质中的其他极性干扰物共洗脱，导致严重的基质效应，尤其在咖啡等复杂基质中，干扰峰常与丙烯酰胺邻近甚至重合，造成定量结果严重偏高。已有研究证实这种干扰来源于N-乙酰基-β-脯氨酸在离子源内的裂解产生的碎片离子，该碎片与丙烯酰胺同分异构，无法通过二级质谱或高分辨质谱区分。因此，实现有效的色谱分离是解决这一问题的可行策略。虽然有研究者尝试使用改性C₁₈柱、亲水相互作用色谱、离子排斥色谱或多孔石墨碳柱等方法，但现有基于多孔石墨碳的方法通常采用两步固相萃取流程，前处理繁琐且掩盖了色谱柱本身的基质耐受能力。

本研究的研究人员提出假设：利用多孔石墨碳柱对强极性化合物的强保留特性，结合简化的单步混合模式阳离子交换固相萃取净化，可以有效将丙烯酰胺与复杂食品基质中共洗脱的干扰物分离，从而降低基质效应并提高定量准确性，并系统评估了多孔石墨碳柱相比传统极性C₁₈柱的真实抗干扰能力。

二、关键技术方法

研究人员建立了基于多孔石墨碳柱的液相色谱-串联质谱分析方法。样品前处理参照GB 5009.204-2025标准：称取2.00 g均质样品，加入丙烯酰胺-¹³C₃同位素内标后静置渗透，加水分散振荡离心，取上清液用正己烷脱脂，再加入乙腈和萃取盐包进行盐析，取乙腈层过MCX固相萃取柱收集流出液，氮吹浓缩后用0.3 mL水复溶过滤膜待测。色谱分离分别采用Hypercarb HT多孔石墨碳柱和Kinetex Polar C₁₈柱进行对比，流动相为含0.1%甲酸的水和甲醇。质谱采用正电喷雾电离和多反应监测模式，丙烯酰胺定量离子对为m/z 72.1→55.1，定性离子对为m/z 72.1→44.1，内标定量离子对为m/z 75.1→58.1。方法验证选用肉制品和咖啡样品，其中空白咖啡基质采用未烘焙的生咖啡豆替代。

三、主要研究结果

3.1 色谱分离性能比较

与传统极性C₁₈柱相比，多孔石墨碳柱显著增强了丙烯酰胺的保留能力，实现了与干扰峰的基线分离。在肉制品基质匹配标准溶液的分析中，C₁₈柱上丙烯酰胺保留弱且与干扰峰分离不佳，而多孔石墨碳柱则获得了良好的分离效果。在咖啡样品中，C₁₈柱分析时丙烯酰胺峰和内标峰均受到强烈干扰，而多孔石墨碳柱有效分离了这些干扰。此外，多孔石墨碳柱可使用更高比例的有机溶剂（甲醇从2%提高至30%），显著提升了电喷雾电离效率，使相同浓度下内标的响应信号增加了72.5%。

3.2 质谱参数优化

通过直接进样方式优化了去簇电压和碰撞能量，最终确定最优去簇电压为50 V，最优碰撞能量为16 V。丙烯酰胺的主要碎片离子为m/z 55.1（丢失氨分子形成的丙烯酰阳离子）和m/z 44.1，分别作为定量离子和定性离子。内标丙烯酰胺-¹³C₃的定量离子为m/z 58.1。

3.3 流动相优化

比较不同流动相组成后发现，甲醇比乙腈提供更好的峰形和响应，这可能与甲醇作为质子性溶剂能与多孔石墨碳表面形成氢键和电荷诱导偶极相互作用有关。在流动相中添加0.1%甲酸可改善丙烯酰胺的电离效率从而提高响应强度。最终选择含0.1%甲酸的水和甲醇作为流动相。

3.4 甲醇浓度对丙烯酰胺保留的影响

在5%至90%甲醇浓度范围内，丙烯酰胺在多孔石墨碳柱上的保留体积随甲醇比例升高而降低，符合反相色谱基本规律。但在90%升至99%甲醇时，保留体积反而增大，这与典型反相行为相反，可能归因于多孔石墨碳的多重保留机制——空穴形成-色散相互作用占主导地位，而电子对相互作用和偶极相互作用的系统常数呈非线性变化。

3.5 方法学验证与比较

方法在10–500 μg/L浓度范围内线性良好，相关系数达0.9994–0.9998。多孔石墨碳柱对肉制品和咖啡的加标回收率分别为94.2–101.5%（RSD 1.5–5.4%）和100.5–103.4%（RSD 0.8–4.6%），完全满足AOAC附录F和SMPR 2022.006标准的要求。而C₁₈柱分析咖啡时回收率高达99.0–272.2%，严重超出可接受范围。多孔石墨碳柱的检出限和定量限分别为0.81–1.38 μg/kg和2.70–4.61 μg/kg，远低于欧盟法规要求的≤50 μg/kg。基质效应评价显示，多孔石墨碳柱的基质效应值为60.6–76.5%，显著高于C₁₈柱的46.8–51.3%（配对t检验p < 0.05），表明信号抑制程度更小。

3.6 实际样品测定

将所建方法应用于68份实际样品分析，包括闽南特色食品（炸醋肉、蛎饼、寸枣、麻酪）、薯片、饼干、烘焙咖啡豆和速溶咖啡。所有样品的丙烯酰胺含量均在合理范围内，与欧盟基准水平比较，大部分样品低于相应基准值，仅烘焙咖啡豆均值略高于400 μg/kg的基准值。

四、讨论与结论

研究人员指出，虽然本方法在提高丙烯酰胺保留和分离方面具有优势，但仍存在一些局限性：方法验证主要针对肉制品和咖啡，未涵盖婴幼儿食品、可可制品和谷物等其他含丙烯酰胺的食品；使用生咖啡豆替代烘焙咖啡作为空白基质可能不能完全代表烘焙后的基质组成；部分基质的样本量较小；尽管多孔石墨碳柱的基质效应优于C₁₈柱，但残余基质效应并未完全消除，其在校正效果仅在已验证的基质中得到确认。未来研究方向应包括扩大样品量和基质种类、开展实验室间验证和日间精密度研究、将多孔石墨碳柱分离策略与高分辨质谱联用以进一步确认共洗脱干扰物的身份，以及将该方法扩展至其他极性食品加工污染物的同时测定。

研究结论：基于多孔石墨碳柱建立了食品中丙烯酰胺分析的液相色谱-串联质谱方法。通过采用单步过柱式MCX净化，评估了多孔石墨碳柱在复杂基质中的固有抗干扰能力。多孔石墨碳柱对极性化合物提供强保留，从而改善了丙烯酰胺与共洗脱干扰物的色谱分离，减少了反相色谱柱上常见的高估问题。与使用C₁₈柱的传统液相色谱-串联质谱方法相比，该方法在干扰可控的基质（如肉制品）中提高了灵敏度，并有效防止了在咖啡等复杂基质中的严重高估。虽然在复杂基质中观察到残余基质效应（60.6–76.5%），但其影响可通过同位素标记的内标物在已验证的基质（肉制品和咖啡）中进行有效校正，支持对这些特定基质的可靠定量。观察到的两柱间基质效应差异具有统计学意义，但严格限于本研究评估的具体基质和实验条件。因此，该基于多孔石墨碳柱的方法为严格在这些已验证的复杂食品基质中进行丙烯酰胺的常规监测提供了一种实用途径。