层状双氢氧化物表面化学工程调控抗原吸附用于寨卡病毒纳米疫苗开发

《Nanomaterials》：Surface Chemistry Engineering of Layered Double Hydroxides for Antigen Adsorption in Zika Virus Nanovaccine Development

　　

层状双氢氧化物（LDH）因其生物相容性和可调控的表面性质，是颇具前景的疫苗递送纳米载体。本研究评估了LDH及含氨基（LDH–NH2）和羧基（LDH–COOH）基团的表面功能化衍生物作为重组寨卡病毒（ZIKV）抗原（rpZDIII）递送平台的效果。纳米颗粒通过共沉淀/水热处理合成，随后经硅烷化和琥珀酰化进行功能化。其理化表征包括流体力学尺寸、ζ电位、零电荷点和氨基浓度，并结合傅里叶变换红外光谱和热重分析。采用牛血清白蛋白、α-糜蛋白酶和重组抗原rpZDIII评估蛋白质吸附。细胞毒性和免疫原性分别于HEK-293T细胞和BALB/c小鼠中评价。功能化影响了蛋白质吸附容量及其洗涤后的保留率。rpZDIII的吸附最符合Freundlich模型，其中LDH–NH2具有最高的抗原吸附量和保留率。在较低纳米颗粒浓度（12.5–50 μg/mL）下，三种制剂均维持高细胞活力。免疫研究表明，所有纳米颗粒制剂均能诱导针对rpZDIII的强抗体应答；然而，仅未修饰LDH诱导的抗体能够结合全长重组ZIKV包膜蛋白。上述结果表明，LDH的表面化学影响抗原的吸附、保留及其后续免疫识别，凸显了在基于LDH的纳米疫苗设计中保持抗原可及性的重要性。

寨卡病毒（ZIKV）属黄病毒科虫媒病毒，孕期感染可致小头畸形，成人感染与吉兰–巴雷综合征相关；截至2025年尚无获批疫苗，仅有mRNA疫苗与DNA疫苗两个候选进入II期临床试验，灭活疫苗和病毒载体疫苗仅达I期。亚单位疫苗安全性好、便于长期储存与分发，但多需佐剂。层状双氢氧化物（LDH）为带正电层板与层间水合阴离子构成的无机黏土，具生物相容性和佐剂性，其天然正电荷适于吸附带负电抗原，已被用于黑色素瘤、淋巴瘤、大肠杆菌、百日咳杆菌及猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）、严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）、猪流行性腹泻病毒（PEDV）、口蹄疫病毒（FMDV）等疫苗研究。然而，旨在使LDH吸附带正电抗原的表面修饰策略，以及抗寨卡病毒的LDH纳米疫苗均未见报道。基于LDH表面高密度羟基，有机硅烷可用于其功能化，但既往研究未探索有机硅烷修饰LDH以调控抗原–表面相互作用或用于纳米疫苗。为此，研究人员以共沉淀/水热法合成LDH，经（3-氨丙基）三乙氧基硅烷（APTES）硅烷化得LDH–NH₂，再经琥珀酸酐（SA）琥珀酰化得LDH–COOH，系统比较三种表面化学对模型蛋白及重组抗原rpZDIII（ZIKV EDIII衍生抗原与大肠杆菌热不稳定肠毒素B亚单位融合蛋白）吸附、保留和免疫识别的影响，并进行细胞毒性与小鼠免疫原性评价。研究意义在于揭示LDH表面化学在调控蛋白吸附、抗原保留与免疫识别中的关键作用，提出纳米疫苗设计需在载抗原量与保持抗原决定簇之间取得平衡。

关键技术方法（不超过250字）：采用共沉淀结合水热处理合成Mg-Al LDH，经APTES硅烷化及SA琥珀酰化制备氨基与羧基功能化颗粒；以动态光散射（DLS）测定流体力学直径、多分散指数（PDI）与ζ电位，以pH漂移法测零电荷点（PZC），以茚三酮法测伯胺浓度，并行傅里叶变换红外光谱（FT-IR）、热重分析（TGA）与透射电镜（TEM）表征；以牛血清白蛋白（BSA）和α-糜蛋白酶（α-CHY）为模型蛋白、rpZDIII为靶抗原开展吸附等温线与洗涤保留实验，分别拟合Langmuir与Freundlich模型；以HEK-293T细胞行resazurin法细胞毒性评价；以BALB/c小鼠（每组n=5，皮下免疫三剂，每剂5 μg rpZDIII）行免疫原性评价，以酶联免疫吸附试验（ELISA）检测抗体。动物实验经机构伦理委员会批准（CEID-2015-069）。

研究结果

3.1 LDH合成与功能化：新鲜合成LDH流体力学直径为70.3 ± 1.7 nm、PDI 0.133 ± 0.021，TEM与高分辨TEM确认Mg-Al LDH晶畴；硅烷化后增至109.5 ± 6.6 nm，羧化后进一步增至152.4 ± 5.3 nm，PDI均低于0.3。ζ电位由LDH的+50.5 ± 5.7 mV降至LDH–NH₂的+36.6 ± 1.3 mV，LDH–COOH转为?24 ± 3.3 mV，反映氨基与羧基共存及LDH本征正电荷导致的异质表面。茚三酮法显示硅烷化后伯胺为597.2 ± 39.6 μM（2 mg/mL），琥珀酰化后降至约25 ± 7.2 μM，转化率约95.8%，残余氨基源于位阻与表面可及性差异。PZC分别为LDH 8.06、LDH–NH₂ 8.01、LDH–COOH 7.19，羧化使PZC向酸性偏移但幅度有限，归因于残余氨基、LDH本征电荷及表面锚定基团的有效pKa效应。细胞毒性显示，12.5–50 μg/mL下各制剂细胞活力均>85%；浓度≥100 μg/mL时LDH与LDH–NH₂活力显著下降，而LDH–COOH在48与72 h仍保持约75–90%；多数组合48至72 h活力显著回升，呈时间依赖性；疫苗所用颗粒浓度低于50 μg/mL。

3.2 蛋白质吸附研究：以BSA（pI 5.1，中性pH带负电）与α-CHY（pI 8.52，中性pH带正电）开展探索性吸附，数据拟合Langmuir模型。BSA在未修饰LDH上拟合最大容量最高，LDH–NH₂的K_L最低，羧化降低吸附容量与表观亲和力；α-CHY在LDH–COOH上容量最高、K_L最低。洗涤后BSA仍保留于LDH与LDH–NH₂，LDH–COOH几乎无吸附；α-CHY则仅保留于LDH–COOH。表明表面功能化既影响吸附量也影响结合强度，而抗原过早释放可能削弱纳米颗粒递送优势。尺寸分析显示低BSA浓度下载体低于200 nm、PDI<0.2，中间比例（1:0.5）出现尺寸显著增大，提示部分覆盖引起颗粒间桥联，高浓度下空间稳定改善；α-CHY负载体系较稳定。ζ电位随吸附量增加呈比例偏移，静电互补体系尤为明显。rpZDIII吸附中，未修饰LDH流体力学直径增幅最明显，归因于其粒径小、单位质量颗粒数多、比表面积大及位阻较小；最高颗粒/蛋白比下各体系尺寸与PDI下降，提示空间稳定抑制聚集。尽管尺寸增大、ζ电位趋近中性，体系仍稳定，源于空间位阻与非静电相互作用。rpZDIII吸附最符合Freundlich模型，LDH–NH₂吸附容量最高，其次为LDH与LDH–COOH；吸附在pH 8.1（LDH与LDH–NH₂净表面电荷近零）下仍有利，说明静电作用不能完全解释吸附行为。洗涤后LDH–NH₂在各比例下rpZDIII保留量最高。

3.3 FT-IR：LDH在3470 cm^?1（O–H伸缩）、1640 cm^?1（H–O–H弯曲）、1360–1370 cm^?1（NO₃^?及CO₃^2?不对称伸缩）、850–860 cm^?1（碳酸根面外弯曲）、620–540 cm^?1（Al–O、Mg–O）处有特征带。硅烷化后出现1485与1574 cm^?1（NH₂变形与剪式弯曲）、1200 cm^?1（硅氧烷桥）、1130与1040 cm^?1（Si–O–Si与Si–O）、619 cm^?1（Si–O–Mg(Al)）及2932 cm^?1（CH₂）等新带；2400–3800 cm^?1去卷积显示3682 cm^?1带消失、3482 cm^?1带位移与强度下降，新增3379与3142 cm^?1伯胺带，证实APTES共价接枝。LDH–COOH出现约2978与2939 cm^?1（琥珀酰胺酸衍生物CH₂）及1630–1560 cm^?1羧酸根不对称伸缩带。LDH–NH₂-rpZDIII出现1640与1537 cm^?1的酰胺I与酰胺II带；酰胺I区去卷积显示rpZDIII以β-折叠为主（1618–1620 cm^?1及1682–1708 cm^?1反平行β-折叠），含少量α-螺旋（1649 cm^?1）与β-转角（1671 cm^?1），与AlphaFold预测一致；吸附后α-螺旋贡献下降、β-折叠相关带增强，提示构象重排，但α-螺旋信号可能被水与β-折叠带部分遮蔽；3800–2600 cm^?1区约3300与3050 cm^?1的酰胺A、酰胺B带强度增加，进一步支持rpZDIII成功吸附。

3.4 TGA：30–120 °C失重对应物理吸附水，120–170 °C对应层间水脱除，主脱水事件在175–180 °C；约950 °C失重归因于硫酸根、碳酸根、硝酸根分解及金属氧化物形成与结构重排。未修饰LDH呈多步脱水（DTG峰90、161、184 °C），170–280 °C为脱羟基与层间碳酸根部分分解重叠，约323 °C为Mg–OH脱羟基。LDH–NH₂在179 °C出现强峰，对应物理吸附与缩聚硅烷释放；300–500 °C失重对应烷基链分解、C–Si键断裂与接枝硅烷结构破坏，峰形宽反映多种结合方式。LDH–COOH在326、351、464 °C出现DTG峰，后两者对应有机官能团两步降解。LDH–NH₂–rpZDIII（颗粒/抗原比1:0.125）第二阶段DTG峰形改变并略向高温移动，去卷积得323 °C（脱羟基）、343 °C（硅烷分解）及约295、370、428 °C三个新特征，可能与蛋白热降解相关，但归属仅为初步推测。定量方面，硅烷化在120–450 °C失重1.48%，LDH与LDH–NH₂终点失重差3.68%，与茚三酮法（2.67%）相当；按理论接枝伯胺3.41%（820 μM）计，胺化效率为43.5–78.2%。羧化样品220–550 °C失重2.85%，与茚三酮法（2.85%）吻合。rpZDIII吸附体系终点总失重13.22%，间接证明蛋白负载。

3.5 免疫原性评价：按颗粒/抗原1:2吸附并洗涤后，将抗原浓度调至25 μg/mL，抗原保留率分别为LDH 71%、LDH–NH₂ 86%、LDH–COOH 64%，最终颗粒浓度为LDH与LDH–NH₂各25 μg/mL、LDH–COOH 36 μg/mL。ELISA显示三种制剂均诱导针对rpZDIII的显著抗体应答，组间无统计学差异且均显著高于载体对照；但针对全长ZIKV E蛋白，仅未修饰LDH诱导的抗体应答显著高于LDH–NH₂、LDH–COOH与载体对照，后三组间无显著差异。作者指出，LDH–NH₂抗原保留更高却未带来更强E蛋白识别，提示表面化学可能影响吸附抗原的取向或构象从而遮蔽E表位；rpZDIII含LTB融合部分，针对rpZDIII的抗体可能包含抗LTB抗体，故不等于对全长E蛋白表位的等效识别。研究局限包括：抗体仅在单一血清稀释度下测定，未确定终点滴度；ELISA仅测结合而非病毒中和；因载抗原量差异未固定颗粒剂量，且未设可溶性rpZDIII对照；抗原取向与构象变化未表征。

讨论与结论

讨论指出，LDH表面电荷变化不能归因于单一官能团，而源于多种表面物种分布及其与LDH晶格的配位；表面锚定氨基与羧基的表观pKa受界面pH与静电效应调控，故PZC反映集体表面电荷调节过程。模型蛋白结果表明，吸附容量本身不足以预测洗涤后保留率，评估吸附稳定性对载体设计至关重要。免疫学差异的可能解释包括表面化学改变抗原取向或构象、遮蔽ZIKV E衍生表位，以及LTB融合部分对抗体应答的贡献，但上述机制均待进一步验证。结论译文：本研究表明，LDH纳米颗粒的表面化学可通过硅烷化及后续羧化进行修饰，从而显著改变粒径、表面电荷、零电荷点、蛋白吸附行为及生物学性能；ζ电位、茚三酮法、FT-IR与热重分析证实氨基与羧基的成功引入。以BSA与α-CHY为模型蛋白的吸附研究显示，表面功能化强烈影响吸附容量与吸附稳定性；洗涤实验表明仅凭吸附容量不足以预测蛋白保留，凸显评估吸附稳定性对纳米颗粒递送系统设计的重要性。重组rpZDIII抗原成功吸附于所有纳米颗粒制剂，其吸附行为符合Freundlich模型描述的异质表面相互作用；LDH–NH₂洗涤后抗原吸附量与保留率最高，FT-IR与热重分析证实蛋白固定及吸附抗原热稳定性提高。所有制剂在免疫所用浓度下维持HEK-293T细胞高活力，支持其初步体外细胞相容性，但不构成纳米疫苗整体安全性的证据，尚需包括体内研究在内的进一步实验。免疫原性研究表明三种LDH制剂均诱导针对rpZDIII的强抗体应答，但仅未修饰LDH诱导的抗体显著识别全长ZIKV包膜蛋白（相对对照组）。上述结果提示，增强抗原负载未必转化为对相关病毒表位的更优免疫识别，纳米颗粒表面功能化可能影响吸附后抗原的取向、构象或表位可及性。总体而言，LDH表面化学在调控蛋白吸附、抗原保留与免疫识别中起关键作用；研究强调纳米疫苗设计需在抗原负载与抗原决定簇保持之间取得平衡，并确定未修饰LDH为本工作中维持所评价ZIKV包膜表位免疫原性最有效的制剂。