纳米差示扫描荧光法（nanoDSF）在药物发现中的进展、应用与局限性

《Expert Opinion on Drug Discovery》：Nano differential scanning fluorimetry in drug discovery: advances, applications, and limitations

纳米差示扫描荧光法（nanoDSF）通过监测靶蛋白在热变性过程中内在色氨酸（Trp）和酪氨酸（Tyr）荧光的变化，提供了一种无标记的方法，用于评估早期药物发现中的蛋白质稳定性及配体结合情况。 涵盖领域：研究人员考察了nanoDSF与染料依赖型差示扫描荧光法（dye-based DSF）之间的技术差异，包括样品需求量、通量、缓冲液与溶剂兼容性以及光学伪影。此外，本文还介绍了nanoDSF在片段筛选、命中验证以及对寡聚体、变构、膜蛋白、邻近诱导降解模式（proximity-induced degradation modalities）和RNA结合靶点的表征中的应用。最后，本文重点指出了由报告基团分布、非协同性解折叠、聚集及复杂基质所引发的局限性。本综述基于对PubMed和Google Scholar中2001年至2026年间发表文献的检索。 专家观点：nanoDSF最有价值的定位是作为一种依赖于具体情境的一级或正交方法，而非一种通用的高通量替代方案。其未来的影响力将取决于自动化程度、原始荧光与散射数据的分析、经过验证的重组体系以及与定量结合、结构和功能分析的整合。将其扩展到类细胞基质将需要针对特定靶点进行信号解卷积。

主体内容总结

1. 引言

1.1 早期药物发现中的挑战：某些靶点因传统小分子难以深入疏水结合口袋而被视为“不可成药”。例如蛋白质-蛋白质相互作用表面通常较大且平坦，而KRAS等GTP酶的核苷酸结合口袋高度保守，缺乏选择性靶向的结构基础。因此，当代生物物理方法不仅需要维持足够的通量以覆盖大型化合物库，更关键的是要提供高信噪比和灵敏度以检测微弱扰动（如低亲和力结合事件）。成熟的方法如核磁共振（NMR）、表面等离子体共振（SPR）和等温滴定量热法（ITC）虽能更可靠地确认靶点结合，但可扩展性较差且样品需求量大，因此在早期药物发现中存在对小体积、无标记分析方法的需求缺口。

1.2 文献检索方法学：在PubMed和Google Scholar中检索2001至2026年间的出版物，检索词包括“纳米差示扫描荧光法”、“内在荧光”、“差示扫描荧光法”和“热位移分析”，并结合药物发现、片段筛选、膜蛋白、生物制剂、蛋白质-RNA相互作用、抗体、聚集和靶向蛋白质降解等相关术语。优先选择了与实验性能、实验限制及药物发现应用相关的主要研究和方**论研究。

1.3 从染料型DSF到nanoDSF的演变：差示扫描荧光法（DSF）最初以ThermoFluor平台在20世纪90年代末被引入，后因SYPRO Orange与实时聚合酶链反应（PCR）热循环仪的光学滤光片兼容而广泛应用。2013年，卡罗林斯卡学院的Nordlund教授团队引入了细胞热位移分析（CETSA），实现了在完整细胞中直接评估药物靶点结合。约在同一时期（2012-2014年），NanoTemper Technologies推出了纳米差示扫描荧光法（nanoDSF），其关键创新是完全消除了任何外部化学染料，转而依赖样品中已有的天然荧光基团。

1.4 nanoDSF原理：nanoDSF监测内在色氨酸（Trp）和较弱强度的酪氨酸（Tyr）荧光。热解折叠会改变残基极性和溶剂可及表面积，从而改变330 nm和350 nm处的发射光。记录330 nm（F₃₃₀）和350 nm（F₃₅₀）的荧光发射，通常使用温度依赖的F₃₅₀/F₃₃₀比值来识别转变。去除外部染料减少了操作步骤和与报告基团相关的伪影，但仍需解折叠或配体结合能够改变一个或多个芳香族报告基团的微环境。

2. 技术与方法学进展

2.1 染料依赖型与无染料检测：传统的DSF使用SYPRO Orange等外部染料，其荧光在水溶液中强烈猝灭，但与热解折叠过程中暴露的疏水斑块结合后增强。SYPRO Orange兼容标准PCR光学模块，但化合物在其检测窗口内吸收或发射可能产生干扰。染料本身会结合解折叠过程中暴露的疏水区域，这些区域也是配体、辅因子或添加剂可接触的表面，导致假阳性或假阴性结果。此外，SYPRO Orange与许多含去垢剂的配方不兼容，这尤其影响膜蛋白的研究。nanoDSF则通过跟踪内在Trp和Tyr荧光来消除外部报告基团，避免了染料与化合物、去垢剂或缓冲液成分的相互作用。然而，“无染料”并不意味着无干扰：在激发波长附近有吸收的化合物会产生初级内滤效应，降低到达蛋白质荧光基团的光强；在发射波长的吸收则产生次级内滤效应，可能扭曲F₃₅₀/F₃₃₀基线或转变曲线。化合物的自身荧光也可能掩盖蛋白质的信号。所有DSF形式都对文库组分的荧光特性敏感，实际影响取决于化合物浓度、光谱重叠、光路长度和荧光收集几何结构。

2.2 样品效率与通量：nanoDSF通常兼具低样品需求和并行采集能力。Prometheus NT.48每次运行可测量48根毛细管，每根上样体积10 μL。在片段筛选中，筛选768个成员的DSi-Poised文库需要16次运行，每次约1.5小时，三到四天完成。其通量受限于运行时间而非样品制备，但仍低于染料型DSF在自动化384孔板中的通量。实验选择必须依据文库规模、靶点行为以及染料相关与内在荧光干扰的相对风险。

2.3 缓冲液、溶剂与基质兼容性：去除染料拓宽了nanoDSF可测试的缓冲液和添加剂范围，但缓冲液组成仍会影响蛋白质稳定性和光学基线。还原剂、pH值、离子强度、赋形剂、共溶剂和两亲物都会影响蛋白质热力学和光学基线。nanoDSF可用于筛选去垢剂，指导膜蛋白的去垢剂选择，前提是每个条件都是可解释的。已发表的片段筛选工作流程通常在低终浓度DMSO下运行。沉淀可能模拟结合响应，因此表观位移必须结合毛细管外观和散射数据进行解读。

2.4 与互补技术的整合：Bruch等人将nanoDSF与冷冻电镜（cryo-EM）、尺寸排阻超高效液相色谱（SE-UPLC）、SPR和氢氘交换质谱（HDX-MS）相结合，以阐明基于Beta变异株的加强疫苗的交叉中和能力。nanoDSF显示冷存材料的第一热转变温度低于37°C孵育的材料，表明其构象稳定性较低。SE-UPLC显示两种条件下三聚体状态均得以保持，但37°C处理的样品洗脱时间更晚，表明群体更紧凑、构象更均一。Cryo-EM直接在结构层面显示了相同的区别。这表明nanoDSF信号不仅反映了通用热稳定性，也反映了溶液中不同共存构象状态间的平衡。

3. 靶点结合与命中验证中的应用

3.1 高通量筛选与基于片段的药物发现：ΔT_m表示配体诱导的表观熔解温度变化。对于可逆解折叠，配体仅与天然态结合会增加表观T_m；若也结合解折叠态，则位移取决于两者在转变温度下的相对效应。负ΔT_m不应被解释为解折叠态结合的证据。ΔT_m应被用于识别初步热力学命中，而非按亲和力排序化合物。对于聚焦文库和片段文库，当靶点产生可重复、可解释的热转变且化合物在筛选浓度下光学兼容时，推荐将nanoDSF作为一级生物物理筛选手段。热力学命中的确认需要独立的直接结合证据。

3.2 设定与验证命中阈值：当使用ΔT_m作为区分命中的决策标准时，建议从同一轮实验中复制对照的变异性推导经验阈值，并在筛选开始前固定下来，而非采用先验的常规值。已发表的nanoDSF研究展示了这些阈值的巨大差异。决策阈值应在排除光学伪影后应用。

3.3 区分结合物与实验伪影：筛选前，应对化合物进行泛分析干扰化合物（PAINS）警报、反应性基序和已知聚集体的注释。弱片段常在高浓度下测试，增加了溶解度相关伪影的风险。需通过比较化合物单独、蛋白质单独以及蛋白质-化合物混合样品来区分沉淀和光学伪影与蛋白质依赖性响应。应记录初始荧光、毛细管外观和散射数据，并对候选命中进行浓度梯度复测。若确认存在干扰，可选择具有不同光谱窗口的验证过的报告基团。

3.4 结合热力学：将热位移解释为解离常数需要明确的解折叠模型。化学变性法提供了另一种选择，即在选定温度下通过变性剂浓度梯度估算亲和力。配体结合会移动中点，通过拟合解折叠曲线的变化可得到模型依赖的K_D估计值。该方法也已无标记地应用于整合膜蛋白。热解折叠本身也可通过测量配体浓度系列下的T_m并进行拟合来定量使用。这些亲和力估计仍是模型依赖的。

3.5 案例研究

3.5.1 寡聚体界面：Thabault等人开发了一个筛选级联，以鉴定靶向乳酸脱氢酶（LDH）四聚体界面的化合物。他们利用nanoDSF对四聚体LDH-1和LDH-5以及一个工程化的二聚体构建体进行评估。预期界面结合配体会使天然四聚体失稳，同时稳定二聚体中暴露的界面。nanoDSF鉴定了八种具有这种差异性热特征的化合物，随后通过微量热泳动（MST）和饱和转移差谱（STD）NMR进行了验证。最终选择的化合物对四聚体LDH的结合亲和力低于对二聚体LDH，与化合物和天然亚基竞争一致。

3.5.2 隐蔽性与变构口袋：Maus等人利用寨卡病毒NS2B-NS3蛋白酶研究了这一问题。他们结合nanoDSF、单分子福斯特共振能量转移（smFRET）、常规DSF和¹⁹F-NMR光谱进行分析。nanoDSF实验显示，竞争性活性位点抑制剂I_c产生浓度依赖的正热位移，而变构抑制剂I_a则导致负ΔT_m。该研究表明，当nanoDSF的热特征与NMR和smFRET整合时，可以提供关于哪个构象集合负责配体结合的可靠读数。

4. 新兴前沿：具有挑战性的生物分子与模式

4.1 膜蛋白与G蛋白偶联受体：对于膜蛋白，染料与胶束的相互作用使得报告基团兼容性高度依赖于增溶环境。nanoDSF将比较范围从去垢剂选择扩展到替代膜模拟物的评估。Flayhan等人将肽转运蛋白和机械敏感通道重组到皂皮素脂质纳米颗粒中，发现通道在皂皮素-脂质环境中比在DDM中更稳定。近期通过构建不含Trp和Tyr的支架蛋白，解决了纳米盘与内在荧光检测的兼容性问题。推荐将nanoDSF作为选择膜蛋白制备方法的主要手段，并通过比较跨构建体、去垢剂和脂质模拟物的热稳定性和聚集情况进行。对于配体发现，建议将其与结合或功能分析互补使用。

4.2 生物制剂与抗体药物偶联物：对于生物制剂，热稳定性是关注的性质本身而非配体结合的指标。抗体的解折叠并非一步完成，nanoDSF的一阶导数图谱中最早的转变通常归因于CH2结构域。解折叠起始温度（T_onset）可能在区分候选药物的可开发性方面优于表观T_m。背向反射记录允许直接比较构象稳定性和胶体稳定性，两者未必一致。构象稳定性与胶体稳定性的区分对抗体药物偶联物（ADC）至关重要。Beckley等人和Kaempffe等人的研究表明，偶联位点和抗体骨架会影响热稳定性，但这种热失稳不一定与体内清除速率或制造过程中的聚集倾向相关。热解折叠和聚集测量仍是长期稳定性的加速替代指标，不能可靠预测数月储存期间的聚集。

4.3 邻近诱导降解模式：PROTACs的药理活性取决于POI-PROTAC-E3三元复合物的群体、协同性、几何结构和寿命。对于PROTACs，专用的三元复合物测定法（如TR-FRET、SPR）比热解折叠更适合表征靶蛋白向E3连接酶的招募。nanoDSF在评估单个蛋白伙伴的热响应方面具有辅助作用。Keuler等人检查了靶向NLRP3的PROTACs，分别测试其NACHT结构域和招募的E3连接酶，提供了与两个结合臂不同贡献一致的证据。Mabanglo等人使用常规DSF作为正交读数，比较了单独的DCAF1和WDR5与等摩尔的DCAF1-WDR5-PROTAC混合物。结果表明，nanoDSF可用于选择具有可重复热特征和有限聚集的构建体和实验条件，但这并不等同于对亲和力、协同性或降解效力的排序。

4.4 核酸与蛋白质-RNA复合物：RNA结合蛋白（RBPs）是新兴的药物发现靶点类别。nanoDSF可以报告RNA或化合物与蛋白质结合后的构象后果，但由于信号主要来自蛋白质，它不能直接测量RNA的解链。Sikorska等人对全长RIG-I的研究表明，双链RNA配体提高了表观熔解温度，且5‘-三磷酸化RNA的稳定效果优于5’-OH对应物。Qiu等人利用nanoDSF作为正交筛选手段，鉴定出破坏YTHDF2-m⁶A-RNA相互作用的化合物，并随后通过MST和CETSA确认了直接结合。在这些应用中，nanoDSF被定位为快速、无标记的确认工具，而非独立评估蛋白质-RNA相互作用的测定方法。

5. 当前局限与技术瓶颈

5.1 内在荧光基团依赖性：NPM1的例子说明了内在荧光基团依赖性。野生型NPM1的C端结构域含有两个Trp，但在AML相关的突变体中，这两个Trp均丢失，导致nanoDSF信号显著减弱，可能使其对该特定构建体信息不足。然而，原生序列中缺乏Trp并不妨碍nanoDSF的应用。KRAS G12C抑制剂JMKX1899的研究中，虽然KRAS缺乏Trp，但Tyr残基可能贡献了可测量的内在荧光响应。同样，不含Trp的人类HSP10也能产生可测量的加热和冷却转变。因此，适用性取决于构建体是否能产生可测量、可解释的内在荧光转变。