编码超强毒传染性法氏囊病病毒（vvIBDV）VP2蛋白的mRNA-LNP疫苗对vvIBDV攻毒提供有效保护

《Microorganisms》：The mRNA-LNP Vaccine Encoding Viral VP2 Confers Effective Protection Against Very Virulent Infectious Bursal Disease Virus (vvIBDV)

　　

传染性法氏囊病（IBD）是由传染性法氏囊病病毒（IBDV）引起的一种禽类急性、高度接触性和免疫抑制性疾病。30多年来，以高死亡率为特征的超强毒IBDV（vvIBDV）在全球广泛流行，给家禽养殖地区造成相当大的经济损失，从而阻碍产业健康发展。然而，现有活疫苗存在毒力返强风险，且易受母源抗体干扰；灭活疫苗常导致保护不足。因此，迫切需要开发安全性和效力更高的新型疫苗。本研究中，研究人员首次开发了一种编码vvIBDV VP2蛋白的mRNA疫苗。通过体外转染实验证实mRNA-HLJVP2可高效表达蛋白。鸡免疫实验表明，三种不同剂量的mRNA-HLJVP2-LNP可诱导特异性中和抗体，并显著提高分泌IL-4的CD4⁺ T细胞和分泌IFN-γ的CD8⁺ T细胞比例。在随后的攻毒实验中，mRNA-HLJVP2-LNP免疫组显示出良好保护效力，其中单次免疫组（20 μg剂量）可为鸡提供有效保护，使其免于vvIBDV攻毒所致死亡和法氏囊病变。本研究为vvIBDV防控提供了一种有前景的候选疫苗，并凸显其在IBD预防中的临床应用潜力。

一、研究背景与问题
传染性法氏囊病（IBD，infectious bursal disease）是由传染性法氏囊病病毒（IBDV，infectious bursal disease virus）引起的鸡急性、高致死性和免疫抑制性病毒感染，对全球养禽业构成重要威胁。超强毒IBDV（vvIBDV，very virulent IBDV）感染后通常3～5天出现发病高峰；幸存鸡常发生严重免疫抑制，增加继发感染易感性并削弱后续疫苗效果。vvIBDV仍是许多国家的主要流行株和免疫防控主要靶标。现有活疫苗存在毒力返强风险并易受母源抗体干扰；灭活疫苗常保护不足；病毒载体疫苗有时受载体预存免疫限制；免疫复合物疫苗需完整且正确折叠的抗原；这些疫苗对vvIBDV挑战的效力常不足，并可能引起生长迟缓和法氏囊萎缩；活疫苗还可干扰临床检测并有与流行株重组或重配风险。因此，需要开发安全性和效力更高的新型疫苗。mRNA疫苗具有非感染性、无基因组整合、可在细胞内表达天然构象抗原、可快速设计合成和批次一致等优势；脂质纳米颗粒（LNP，lipid nanoparticle）具有较高包封效率、较低细胞毒性和可放大生产等特征，可保护mRNA并促进细胞摄取和胞质释放，同时具有一定佐剂效应。VP2是IBDV主要结构蛋白，含关键中和表位，是病毒诱导抗体的主要靶点。研究人员据此开发并初步评价了编码vvIBDV VP2的LNP递送mRNA疫苗（mRNA-HLJVP2-LNP）。

二、研究开展、结论与意义
研究人员构建了编码vvIBDV HLJ0504株VP2的mRNA-HLJVP2，以LNP包封后形成mRNA-HLJVP2-LNP，经体外转染验证VP2表达，并在SPF鸡中评价三剂量单次免疫的免疫原性和对vvIBDV攻毒的保护效力。结果表明，该疫苗可诱导特异性中和抗体，显著提高CD3⁺CD4⁺和CD3⁺CD8⁺ T细胞比例及IL-4、IFN-γ等细胞因子反应，并在攻毒后保护鸡免于死亡和法氏囊病变。该研究为vvIBDV防控提供了有前景的候选疫苗，并显示mRNA疫苗在IBD临床预防中的应用潜力。

三、关键技术方法
所用vvIBDV HLJ0504株由哈尔滨兽医研究所禽免疫抑制病团队分离保存；rGtHLJVP2为表达HLJ0504 VP2的细胞适应重组病毒；IBDV病毒样颗粒（VLP，virus-like particle）由VP2原核表达制备。SPF（specific-pathogen-free，无特定病原体）白来航鸡57只，14日龄，购自国家禽类实验动物资源库，随机分为阴性对照、攻毒对照及5、10、20 μg免疫组，单次肌注，14 dpi（days post-immunization，免疫后天数）以10 CLD₅₀（50%鸡致死剂量）HLJ0504点眼滴鼻攻毒。关键技术包括mRNA制备与LNP包封表征、IFA/WB、中和试验、流式T细胞亚群、RT-qPCR、脾淋巴细胞CCK-8增殖、ELISA和H&E病理及攻毒保护评价。

四、研究结果
3.1 mRNA-HLJVP2疫苗的制备：研究人员构建含T7启动子、5′UTR、VP2编码序列和3′UTR的质粒，经线性化、体外转录和酶促加帽制备mRNA-HLJVP2；转染HEK-293T后，免疫荧光试验（IFA，immunofluorescence assay）和蛋白印迹（WB，Western blot）检测到VP2表达（约55 kDa）；微流控包封所得mRNA-HLJVP2-LNP平均粒径约88.23 nm、多分散指数（PDI，polydispersity index）0.0747、包封效率94.15%，表明疫苗构建和包封成功。
3.2 mRNA-HLJVP2-LNP在鸡中的免疫原性：13 dpi三个剂量组中和抗体阳性率均为100%（10/10），滴度分别为7.9±1.73、8.4±1.78和8.7±1.06 log₂，表明该候选疫苗可诱导体液免疫。
3.3 外周血T细胞亚群分类及细胞因子检测：流式细胞术显示5、10、20 μg组CD3⁺CD4⁺ T细胞比例显著高于阴性对照（NC）组（p<0.001），分别为NC组的1.41、1.58、1.70倍；CD3⁺CD8⁺ T细胞比例亦显著升高（p<0.01），分别为1.33、1.54、1.58倍；逆转录定量PCR（RT-qPCR，reverse transcription quantitative PCR）显示外周血单核细胞（PBMC，peripheral blood mononuclear cell）中白细胞介素-12（IL-12）、白细胞介素-4（IL-4）、干扰素-γ（IFN-γ）表达显著上调（p<0.05），表明增强Th1型和Th2型细胞因子反应，诱导偏向细胞免疫的应答；13 dpi各组法氏囊和脾正常。
3.4 脾细胞增殖及细胞因子检测：细胞计数试剂盒-8（CCK-8，Cell Counting Kit-8）法显示免疫组淋巴细胞刺激指数显著高于NC组（p<0.05）且呈剂量依赖；酶联免疫吸附试验（ELISA，enzyme-linked immunosorbent assay）显示脾细胞培养上清IL-4（p<0.01）和IFN-γ（p<0.05）显著升高，表明共诱导Th1/Th2免疫。
3.5 mRNA-HLJVP2-LNP疫苗对vvIBDV的免疫保护试验：攻毒后NC组正常，攻毒对照（CC）组症状加重、平均症状指数（MSI，mean symptomatic index）升高，3～5 dpc（days post-challenge，攻毒后天数）分别死亡2、3、3只，7 dpc死亡率80%（8/10）；CC组法氏囊出现炎性渗出、淋巴滤泡萎缩、坏死和间质水肿等，免疫组无法氏囊病变比例分别为70%（7/10）、80%（8/10）、100%（10/10）；CC组法氏囊/体重比显著低于NC组（p<0.001），免疫组与NC组无显著差异；CC组脾肿大、红髓含铁血黄素沉积、坏死灶和巨噬细胞增生，脾/体重比显著高于NC组（p<0.001），免疫组与NC组无显著差异，表明疫苗保护法氏囊和脾。
3.6 病毒载量检测结果：RT-qPCR显示CC组法氏囊和泄殖腔拭子IBDV阳性、NC组阴性；三个免疫组法氏囊和泄殖腔拭子相对病毒载量均显著低于CC组（p<0.01），表明增强病毒清除。

五、讨论总结与结论翻译
讨论部分指出，vvIBDV持续流行和传统疫苗局限促使研究人员探索mRNA疫苗；该平台具有非感染性、无整合和可诱导保护等优势。该研究以VP2为靶抗原，经IFA/WB验证表达，LNP包封后进行三剂量免疫原性评价。三剂量均诱导100%中和抗体阳性，并增强CD4⁺/CD8⁺ T细胞、IL-4、IFN-γ和淋巴细胞增殖；血清ELISA抗体为阴性，原文指出类似表达VP2的活载体疫苗也可出现低ELISA抗体但具良好保护，相关原因尚需研究。攻毒后所有免疫组100%免于死亡，法氏囊保护率随剂量为70%、80%、100%，器官/体重比和病毒载量结果支持保护效果。中和抗体三组无显著差异而细胞免疫指标呈剂量依赖，原文认为保护由体液和细胞免疫共同决定，并需进一步研究免疫指标与保护关系以减少对攻毒试验的依赖。原文强调该疫苗不意在替代现有疫苗，而作为补充商业疫苗，针对活疫苗致病副作用和母源抗体干扰等不足；目前尚无商业IBD mRNA疫苗。未来需在带母源抗体更大鸡群中设空LNP和无关mRNA对照、延长攻毒时间点、与商业疫苗比较、评价交叉保护、母源抗体下免疫原性、胚内和1日龄免疫、成本与储存稳定性、剂量优化、LNP简化及无针免疫等。结论翻译：总之，本研究首次报道了靶向vvIBDV的mRNA疫苗的开发。利用LNP递送系统在宿主中表达VP2蛋白，该候选疫苗有效诱导了鸡强健的体液和细胞免疫应答。因此，它为鸡提供了针对vvIBDV（HLJ0504株）攻毒所致死亡和法氏囊病变的有效保护。这些发现证实mRNA-HLJVP2-LNP是用于控制vvIBDV的有前景候选疫苗。