《Microorganisms》：Integrated Molecular and Serological Epizootic Monitoring of SARS-CoV-2 and Influenza A Virus in Animals in Kazakhstan
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具有广泛宿主范围的呼吸道病毒与兽医流行病学、生物安全及One Health（同一健康）监测相关。本回顾性研究整合伴侣动物与野生动物记录，考察两个互补的监测问题：与人类密切接触的犬、猫中SARS-CoV-2的检测，以及包含野鸟在内的更广泛多物种panel中甲型流
具有广泛宿主范围的呼吸道病毒与兽医流行病学、生物安全及One Health（同一健康）监测相关。本回顾性研究整合伴侣动物与野生动物记录，考察两个互补的监测问题：与人类密切接触的犬、猫中SARS-CoV-2的检测，以及包含野鸟在内的更广泛多物种panel中甲型流感病毒（influenza A virus, IAV）的检测。研究人员分析了2022–2023年在哈萨克斯坦采集的256份存档动物样本，包括158只犬、76只猫及22只其他家养和野生动物。采用既往研发的in-house多重RT-qPCR（multiplex RT-qPCR）检测SARS-CoV-2与IAV RNA，并采用既往研发的in-house SM抗原（SM-antigen）ELISA评估SARS-CoV-2相关血清反应性。SARS-CoV-2 RNA在104/256份样本中检出（40.6%；95% CI，34.8–46.7），包括68只犬和36只猫。IAV RNA在4只野鸟中检出（1.6%）：2只山鹑和2只绿头鸭。按源数据集中记录的检测特异性分类，34份血清为反应性、14份为可疑、208份为非反应性。所有SARS-CoV-2 RT-qPCR阳性样本均为ELISA非反应性；所有反应性或可疑ELISA结果均出现于RT-qPCR阴性动物中。犬与猫在SARS-CoV-2 RT-qPCR阳性率、ELISA反应性或Ct值分布上无显著差异。由于该ELISA未针对所研究动物物种进行正式验证，反应性未被解释为确诊的SARS-CoV-2血清阳性。因此，该2022–2023年存档数据集为哈萨克斯坦多物种呼吸道病毒监测提供了历史基线，并支持分子与血清学数据的审慎整合。
研究背景与问题 具有跨物种屏障能力的呼吸道病毒是兽医微生物学与One Health（同一健康）监测的重要关注对象。SARS-CoV-2为β冠状病毒（betacoronavirus），在自然和实验条件下具有广泛的哺乳动物宿主范围，已记录人→动物的反向人兽共患传播；IAV同样可感染多种禽类与哺乳动物宿主，并可能发生重配（reassortment）与宿主适应。伴侣动物因与人类接触密切而备受关注，但已报道的犬、猫SARS-CoV-2分子与血清学检出频率因采样时期、暴露环境、临床状态和研究设计而差异显著，部分调查未检出，而来自确诊人类COVID-19家庭动物的检出频率较高，提示多数宠物感染与人间→动物传播相关，而非在犬、猫中持续独立循环。动物血清学监测要求检测方法针对所研究物种与抗原靶标进行验证，多物种ELISA虽在实验或自然感染动物中显示较高诊断性能，但跨物种现场监测时需控制交叉反应并以适当阳性、阴性血清panel确认cut-off值。犬、猫可被禽源、马源、猪源或人源流感病毒感染，犬适应的H3N8与H3N2谱系说明IAV可在新哺乳动物宿主中建立传播；犬中重配与宿主适应因伴侣动物与人类处于密切生态界面而具One Health意义。哈萨克斯坦横跨多个生态区，存在人、伴侣动物、家畜、野生动物、动物收容所、兽医诊所与动物园环境之间的界面；近期阿拉木图监测在犬中检出IAV RNA并显示流感暴露的血清学证据，支持该国兽医呼吸道病毒监测的相关性。基于此，研究人员设计本整合性流行监测分析，使用2022–2023年兽医调查期间采集的存档动物样本。尽管样本为历史标本，该数据集仍可作为解读宿主特异性检出模式、设计前瞻性标准化多物种监测的有据基线。研究使用既往研发并完成分析特性表征的in-house多重RT-qPCR与SARS-CoV-2 ELISA系统作为诊断工具，而非以方法学开发为主要目的。主要目标为：描述SARS-CoV-2与IAV分子检出在各动物物种间的分布，描述SARS-CoV-2血清学分类，比较分子与血清学模式，并评估监测数据集内的物种特异性差异。由于样本集为临床富集且非概率抽样获得，所报告比例仅描述受监测动物，不解释为群体流行率估计。此前一份哈萨克斯坦会议论文报告了同一更广泛监测项目中家养动物的SARS-CoV-2检出，本文通过整合IAV分子监测、SARS-CoV-2相关血清学评估、地理与时间分析、比较统计及分子与血清学发现的联合解读，实质性扩展了该早期报告。
主要关键技术方法 研究为回顾性流行监测分析，样本为2022–2023年哈萨克斯坦兽医调查中采集的256份存档动物记录（158只犬、76只猫及22只其他家养与野生动物；犬、猫因与人类密切接触且该临床富集亚群具有符合冠状病毒感染的体征而入组；其他物种来自更广泛的兽医与野外监测活动）。采样点包括兽医诊所、临时收容设施、动物园或圈养环境及哈萨克斯坦多个地区的野外监测点；鼻拭子与直肠拭子置于含磷酸盐缓冲运输液的灭菌管中，全血经凝固、离心分离血清，拭子与血清于?70 °C保存至RNA提取或血清学检测。采用in-house多重RT-qPCR（multiplex RT-qPCR）同时检测IAV与SARS-CoV-2 RNA，荧光分别于Green通道（IAV）与Orange通道（SARS-CoV-2）采集，Ct ≤38判为阳性；采用in-house SARS-CoV-2-IgG-RIBSP-ELISA（基于重组嵌合SM抗原）检测血清反应性，结果按源数据集最终实验室分类取反应性、可疑、非反应性。统计分析采用描述性统计、Wilson 95%置信区间、Fisher精确检验比较犬猫RT-qPCR阳性率与ELISA反应性、双侧Mann–Whitney U检验比较Ct分布，p < 0.05为有统计学意义；因缺乏独立物种特异性血清学参考标准，未计算ELISA敏感性、特异性、预测值或诊断一致性。
研究结果
3.1 研究群体与样本分布：监测数据集含2022年7月至2023年4月采集的256份动物记录，犬158/256（61.7%）、猫76/256（29.7%），其余22/256（8.6%）包括山鹑（n = 4）、绿头鸭（n = 3）、麝鼠（n = 3）、鸡（n = 2）、野兔（n = 2）、乌鸦（n = 2）、狍（n = 2）、河狸（n = 2）、1只雌狮和1只狐；犬与猫合计占监测动物的234/256（91.4%）。
3.2 地理与时间分布：记录覆盖哈萨克斯坦6个地理子集及4个主要采集时段。最大子集来自突厥斯坦州（107/256），其后为阿拉木图（39/256）、阿克莫拉州（34/256）、塔拉兹（34/256）、东哈萨克斯坦州（27/256）和卡拉干达（15/256）。SARS-CoV-2 RT-qPCR阳性样本在全部6个地理子集中均有发现，描述性比例最高为阿克莫拉子集（18/34，52.9%），其后为塔拉兹（16/34，47.1%）、卡拉干达（7/15，46.7%）、突厥斯坦州（46/107，43.0%）、阿拉木图（13/39，33.3%）和东哈萨克斯坦州（4/27，14.8%）；因采样为目标性、各地动物数量与构成不同且非概率抽样，上述比例不解释为地区流行率估计。采样强度在6个子集间明显不均，采集时间亦呈聚集性：5个子集于2022年7–12月采样，突厥斯坦子集另含2023年4月采样；地理子集、采集时段、宿主构成与采样强度部分混杂，不应作为独立地区风险因素分析。
3.3 SARS-CoV-2与IAV的分子检测：全部256份记录均有靶标特异性RT-qPCR结果。SARS-CoV-2 RNA在104/256份样本中检出（40.6%；95% CI，34.8–46.7），其中犬68/158（43.0%；95% CI，35.6–50.8）、猫36/76（47.4%；95% CI，36.5–58.4），其他监测物种中无SARS-CoV-2阳性样本。SARS-CoV-2总体Ct范围为25.87–34.99，均值±SD为32.48 ± 1.61，中位数32.44（IQR，31.22–33.76）。IAV RNA在4/256份样本中检出（1.6%；95% CI，0.6–3.9）：4只山鹑中的2只与3只绿头鸭中的2只，IAV Ct范围为33.12–35.25；未发现SARS-CoV-2/IAV双重RT-qPCR阳性样本。
3.4 ELISA反应性分类：现场血清以SM为基础的SARS-CoV-2 ELISA进行三重复检测。按源数据集最终检测特异性分类，34/256份（13.3%；95% CI，9.7–18.0）为反应性，208/256（81.3%）为非反应性，14/256（5.5%）为可疑。犬中20/158（12.7%；95% CI，8.3–18.7）反应性、127/158（80.4%）非反应性、11/158（7.0%）可疑；猫中14/76（18.4%；95% CI，11.3–28.6）反应性、59/76（77.6%）非反应性、3/76（3.9%）可疑；其他物种全部22份样本均分类为ELISA非反应性。由于该检测的分析特性系以人血清建立，动物血清分类仅表示检测反应性，不解释为确诊的SARS-CoV-2抗体状态。
3.5 分子–血清学关系：全部104份SARS-CoV-2 RT-qPCR阳性样本均分类为ELISA非反应性；152份RT-qPCR阴性样本中，34份为ELISA反应性、14份为可疑、104份为非反应性。因此无RT-qPCR阳性样本同时被判为ELISA反应性或可疑。该模式仅作描述性报告，未作为诊断一致性分析处理，因RT-qPCR检测病毒RNA而ELISA测定抗体相关结合反应性，且ELISA未在本文动物物种中验证。
3.6 犬与猫的比较分析：SARS-CoV-2 RT-qPCR阳性率在犬（68/158，43.0%）与猫（36/76，47.4%）间无显著差异（Fisher精确检验p = 0.575）；ELISA反应性在犬（20/158，12.7%）与猫（14/76，18.4%）间亦无显著差异（Fisher精确检验p = 0.242）。RT-qPCR阳性动物中，犬SARS-CoV-2 Ct中位数32.34（IQR，31.22–33.70；范围25.87–34.99），猫Ct中位数32.55（IQR，31.28–33.76；范围30.12–34.98），Ct分布差异无统计学意义（Mann–Whitney U = 1178，p = 0.756）。结果未显示监测数据集内犬、猫在分子发现或检测定义的ELISA反应性上存在可检测的物种水平差异。
讨论与结论 本研究提供了哈萨克斯坦多物种流行监测数据集中SARS-CoV-2与IAV发现的分子与血清学整合描述，其价值主要在于记录临床富集历史数据集内的宿主特异性模式，而非估计群体流行率。三项观察尤为重要：SARS-CoV-2 RNA仅见于犬、猫，两组伴侣动物比例与Ct分布相当；IAV RNA仅见于野鸟，即山鹑与绿头鸭；分子与ELISA反应性谱不重叠，RT-qPCR阳性动物为ELISA非反应性，而ELISA反应性与可疑分类出现于RT-qPCR阴性动物。由于ELISA未做物种特异性验证，这些血清反应应视为检测反应性而非确诊的SARS-CoV-2抗体证据，分子与血清学发现因而提供两个各自独立、需审慎解读的监测信息层面。犬、猫SARS-CoV-2 RT-qPCR阳性比例高于许多基于群体的宠物调查，这符合该数据集为临床富集而非随机抽样的特点，观察频率受暴露环境、时段、临床选择与采样设计强烈影响；确诊人类COVID-19家庭动物的研究一致显示较广泛筛查人群更高的分子或血清学检出，美国得克萨斯州主动监测亦显示暴露环境强烈影响观察频率（COVID-19 affected households犬4.8%、猫13.4% RT-qPCR阳性，中和抗体分别为25%与36%），而意大利南部猎犬与流浪犬、巴西东南部COVID-19阳性者所属犬猫的研究采用不同采样背景与诊断途径，同样提示跨调查直接数值比较需谨慎；美国国家监测数据亦显示犬猫SARS-CoV-2的临床与流行病学特征随监测环境与暴露背景变化。在更广泛的AR13067641监测项目内，既往获得并表征了一株犬源SARS-CoV-2分离株SARS-CoV-2/Canis lupus familiaris/KAZ/CCoV_Almaty_KZ_2022（GenBank登录号PP898122），但本回顾性分析所用存档数据集无法将该分离株与104份RT-qPCR阳性记录中的某一具体记录进行记录级关联，故未作为本数据集的确认性检测。本文临床选择数据集中的高阳性率应与既往报道的多重检测分析特异性一并解读，不应外推为一般动物群体的感染流行率。犬与猫在本数据集中SARS-CoV-2 RT-qPCR阳性率相近（43.0%对47.4%）且差异无统计学意义，Ct分布亦无差异，不支持监测群体内两物种间可检出病毒RNA强度的物种差异；但其他研究依暴露强度与研究设计报道了易感性、血清学应答与感染概率的物种相关差异，故此处无显著差异应在样本量、临床富集与缺乏标准化暴露史的限制内解读。SARS-CoV-2 RT-qPCR阳性与ELISA反应性的完全分离需审慎解读，不应视为序贯感染阶段的证据或一种方法否定另一种方法；RT-qPCR检测病毒RNA而ELISA测定抗体相关结合反应性，二者信号可发生于不同生物学时间尺度。一种可能解释是部分动物在可检出RNA排毒期采样时尚未产生可测抗体应答，而抗体相关反应性可在RNA不再可检出后持续存在；但仅凭时间无法确定解释该模式，因存档记录缺乏标准化暴露日期、临床症状出现时间与纵向随访。此外，ELISA以人血清表征且未针对所研究动物物种正式验证，反应性信号可能代表SARS-CoV-2特异性抗体、交叉反应抗体或非特异性结合，存档数据无法区分；因此RT-qPCR阴性动物中34份反应性与14份可疑结果仅作为检测分类报告，而非确诊既往感染。确定真实SARS-CoV-2血清阳性与诊断一致性需物种适宜的确认，理想情况下使用病毒中和等独立参考方法。IAV发现将数据集监测价值扩展至伴侣动物之外：4份IAV RT-qPCR阳性检出见于2只山鹑与2只绿头鸭，所有哺乳动物该靶标均为阴性；野生水鸟尤其是鸭科（Anatidae）成员是禽流感病毒生态学的核心宿主，一项2026年野鸟主动监测系统综述与meta分析发现禽流感病毒检出存在显著分类学与生态学变异，并报道水相关与迁徙物种的重要贡献；本文数量过小不足以作群体推断，但绿头鸭与山鹑中的检出支持将野生动物采样持续纳入国家流感监测。阳性发现的地理分布呈描述性异质性，但采样设计不支持因果或基于流行率的地区比较：突厥斯坦州占全部记录的41.8%，卡拉干达仅占5.9%，且各子集采集时段不同；宿主构成亦不均一，东哈萨克斯坦子集含野鸟样本且是唯一检出IAV RNA的地理子集，其他子集以伴侣动物为主；地理因而与宿主构成、采样强度及采集时段部分混杂，地图应解读为数据集覆盖范围的可视化而非空间风险面。研究局限包括：监测数据集非概率抽样生成且以犬猫为主，分子检出比例不能外推至国家动物群体；若干野生动物物种仅1–4只，仅作描述性解读；并非全部记录均具备详细暴露史、owner COVID-19状态、临床症状时间与系列随访样本；ELISA未针对所研究动物物种正式验证且无独立物种适宜确认性血清学方法，故观察到的ELISA分类表示检测反应性而非确诊SARS-CoV-2血清阳性；存档数据集中亦无RT-qPCR阳性记录的记录级序列确认或独立确认性检测结果，尽管更广泛监测项目内既往获得犬源SARS-CoV-2分离株PP898122，本文所用存档数据集未建立该分离株与本分析某一具体RT-qPCR阳性记录的一一对应联系。未来监测应通过标准化流行病学元数据的前瞻性采样、按既定间隔采集配对分子与血清学标本、使用适当参考panel进行物种特异性ELISA验证、确认性中和试验、在可行时开展病毒测序或分离，以及更广泛的空间与季节覆盖加以强化；最终状态工作簿未提供每份记录的完整样本类型字段，故仅凭本数据集无法可靠按样本类型分层阳性率。从One Health角度看，观察到的宿主特异性分子模式凸显了在人、伴侣动物与野生动物界面开展多物种监测的价值：既往研发的多重RT-qPCR系统可同时筛查两个呼吸道病毒靶标，ELISA提供抗体相关反应性的额外信息层；但在动物监测中，此类血清学信号在获得物种特异性验证与独立确认前应审慎解读。在此约束内使用，分子与血清学联合方法可拓宽流行病情境意识，并有助于指导哈萨克斯坦未来经前瞻性验证的兽医监测。
结论部分译文：本研究呈现了哈萨克斯坦临床富集多物种动物数据集中SARS-CoV-2与IAV的整合分子与血清学流行监测。SARS-CoV-2 RNA在104/256份样本中检出（40.6%），仅见于犬与猫，两物种间无显著差异；该比例描述所调查样本集，并非群体流行率估计。IAV RNA在4份野鸟样本中检出（1.6%），包括2只山鹑与2只绿头鸭。按源数据集记录的检测特异性标准，ELISA将34份样本分类为反应性、14份为可疑、208份为非反应性。由于ELISA未针对所研究动物物种正式验证，这些结果不应解释为确诊的SARS-CoV-2血清阳性或既往感染证据。因此，不重叠的分子与ELISA反应性模式需审慎解读，而非诊断等价。该2022–2023年存档发现提供了历史监测基线，并支持持续开展伴侣动物与野生动物的整合监测，在未来的One Health监测中纳入物种特异性血清学验证与确认性检测。
