来源于*Stutzerimonas stutzeri* DIA-8的隐秘质粒pM27181的遗传组织及其微型复制子（minireplicon）在*Escherichia coli*与*Pseudomonas putida*中的宿主依赖性复制调控、分离稳定性与动员能力

《Microorganisms》：Geographic Environment Outweighs Halophyte Identity in Shaping Nitrogen-Cycling Microbial Communities in Coastal Saline Soils

　　

研究人员对从*Stutzerimonas stutzeri*（原*Pseudomonas stutzeri*）菌株DIA-8中分离的隐秘质粒pM27181（15,416 bp）进行了表征。测序与生物信息学分析鉴定出20个开放阅读框（ORF），包括参与复制（*rep*）、动员（松弛酶/动员蛋白）、分离（*par*A、*par*G）及位点特异性重组（XerC样蛋白）的基因，以及推定的Csr/Rsm调控模块。通过缺失分析与随机连接获得了三个微型复制子：pEBNT-1-K、pEBNT-2与pEBNT-3。每个微型复制子均含有一个由*rep*基因和含iteron区域组成的复制模块。三个变体均能在*Escherichia coli*和*Pseudomonas putida*中自主复制。变体pEBNT-3相对于pEBNT-2缺失两个iteron中的一个，该缺失具有宿主依赖性效应。在*P. putida*中，该缺失提高了质粒拷贝数，可能源于负反馈的减弱，但降低了分离稳定性；在*E. coli*细胞中，该缺失降低了拷贝数，而分离稳定性未见相应下降。pEBNT-1-K保留了动员活性，而在所测试条件下pEBNT-2与pEBNT-3未检测到动员，提示其水平传播风险降低。上述结果表明，复制控制具有宿主依赖性，并可能涉及Rep蛋白、iteron重复序列与胞内因子之间的相互作用。这些微型复制子为开发假单胞菌（pseudomonads）遗传工具提供了基础，并为研究不同细菌宿主中的质粒复制提供了模型。

研究背景与问题

质粒是染色体外的遗传元件，在抗生素抗性基因、定殖与毒力因子或毒素（如大肠菌素）编码基因以及辅助代谢功能的水平转移中发挥重要作用，这些性状有助于细菌的进化存续、基因组可塑性与环境适应。与赋予宿主明显可识别优势的质粒不同，隐秘质粒（cryptic plasmid）缺乏与明显有益性状相关的基因，通常较小（约1–10 kb），较大者（10–30 kb）较少见；由于缺乏表型可检测标记，其研究受到阻碍，但隐秘质粒广泛分布于多种生态系统中。因其不赋予宿主明显优势且推测存在维持成本，常被描述为自私遗传元件或遗传"寄生者"，较高的转移率可能有助于抵消其维持相关的负选择；隐秘质粒还可作为获取适应性基因的平台，因其含有复制模块与可移动遗传元件。自主复制是质粒维持的最低要求，复制子（replicon）是包括隐秘质粒在内的任何质粒的关键功能模块。质粒复制子由复制起点（^*Ori^*）及控制复制起始、拷贝数、子代细胞中稳定遗传和宿主范围的元件组成。质粒主要通过三种基于复制的机制调控拷贝数：复制起始蛋白与同源iteron结合、反义RNA调控以及RNA–蛋白联合阻遏。在许多含iteron的质粒中，复制起点区域约一半由重复序列组成，通常长约20 bp，称为iteron，是同源Rep蛋白的特异性结合位点。在Rep浓度较低时，与iteron结合触发复制起始；随着质粒拷贝数增加，Rep介导的不同质粒分子上iteron之间的相互作用（handcuffing）抑制起始并防止过度复制，这种负反馈机制在以Θ型机制复制的低拷贝数质粒中尤为常见。窄宿主范围质粒仅在近缘宿主中复制，而广宿主范围（BHR）质粒的复制子可在广泛宿主中发挥功能。质粒是分子生物学与生物技术的重要工具，可作为基因克隆、基因组编辑与遗传物质递送的载体，可通过去除稳定维持非必需元件进行改造后用于酶表达与代谢途径工程；BHR质粒因能在不同种属细菌中复制而尤为有价值，可动员或可接合的质粒还能促进跨分类屏障的水平转移。^*Stutzerimonas stutzeri^*以高度基因组可塑性为特征，确保其定殖多样生态位的能力，这种适应能力不仅由染色体中大量插入元件（IS）与原噬菌体决定，也由质粒的存在决定；该物种的质粒库既包括隐秘质粒也包括功能重要的染色体外元件，后者包括赋予重金属离子抗性、参与异生物质降解以及携带抗生素抗性基因的质粒。本研究描述了来自^*S. stutzeri^* DIA-8的新型隐秘可动员质粒pM27181的遗传组织，携带卡那霉素抗性盒的缺失衍生物在^*E. coli^*与^*P. putida^*中均保留了复制能力。

主要关键技术方法

研究人员采用牛津纳米孔技术（Oxford Nanopore Technology）结合定制数据分析测定质粒全序列；使用Bakta v1.12.0（完整数据库v6.0）进行序列注释，并用Prokka v1.14.6验证^*xer^*C基因；采用MAFFT v7的L-INS-i算法比对Rep氨基酸序列，trimAl v1.4自动模式修剪，IQ-TREE v2以ModelFinder自动选择最佳氨基酸替换模型构建最大似然系统发育树，100次标准自举重复评估分支支持度；通过^*Bam^*HI酶切片段与卡那霉素抗性盒连接构建缺失衍生物pEBNT-1-K，并以随机连接法构建微型复制子；采用连续传代法测定分离稳定性，以^*aph^*为质粒靶标、单拷贝染色体基因^*rpo^*C为内参，通过定量PCR（qPCR）按Pfaffl法并校正扩增子长度计算相对质粒拷贝数（RPCN）；以^*E. coli^* S17-1为供体、^*P. putida^* PCL1760为受体进行接合转移实验。研究所用菌株与质粒列于原文表1。

研究结果

核苷酸序列注释：通过测序与注释确定pM27181全长15,416 bp，序列提交GenBank（登录号PZ511715），鉴定出20个编码序列（CDS）与1个非编码RNA。注释出可动员质粒特征性基因，包括松弛酶/动员核酸酶（YFW62792）、含动员结构域蛋白（YFW62791）与复制起始蛋白（YFW62793）；此外编码ParA家族ATPase（YFW62789）与DNA结合蛋白ParG（^*par^*G，YFW62788）（二者与质粒稳定遗传相关）、酪氨酸重组酶/整合酶XerC（^*xer^*C，YFW62779）、IS110家族转座酶（YFW62783）以及碳储存调控因子家族RNA结合蛋白（YFW62778），并鉴定出PrrB/RsmZ家族非编码RNA（V3N98_006）；20个开放阅读框中7个注释为功能未知的假定蛋白。未检测到编码VirD4/TraG蛋白或IV型分泌系统（T4SS）组分的基因，而此为接合性质粒转移所必需。复制模块的组织与以θ型机制复制的A类质粒最为一致。Rep蛋白由457个氨基酸残基组成（V3N98_021），BLASTp分析显示与多个^*Pseudomonas^*物种的Rep蛋白氨基酸序列一致性为70–93%；Pfam分析鉴定出C端螺旋–转角–螺旋（HTH）DNA结合结构域（残基418–457），对应^*Pseudomonas^*质粒Rep蛋白特征性的翼状螺旋（WH2）结构域，参与特异性iteron结合，该蛋白因此可能属于WH Rep超家族（包含除IncP-6外大多数IncP群）。未鉴定出共有DnaA结合序列，所有候选位点与经典共有序列至少存在两个错配，提示识别位点可能具有分化；亦未鉴定出IHF结合位点。与IncP数据库参考Rep序列比较，最接近者为质粒pFap29-2（CP016835）的IncP-6 Rep蛋白，一致性52.3%（225/430残基），查询覆盖度93.9%（E值=1.38×10^?145），与其他IncP群蛋白一致性不超过37%；但可靠的分群归属需≥90%一致性，仅凭BLASTp的分类仍不确定。在MOB-suite系统中该蛋白被注释为"IncP"，与pPSEST01（^*S. stutzeri^* RCH2）的Rep一致性93%，与NCBI数据一致；然而如Suzuki等所示，此类标签可能不反映精确的群归属，可代表数据库局限。采用Q.PFAM+G4模型与100次标准自举重复的最大似然系统发育分析将pM27181 Rep蛋白置于IncP-6的姐妹谱系，自举支持率100%。较长的内部分支（每站点1.695个替换）提示显著的进化分化，因此该质粒可能代表IncP群内一个独立的复制子谱系而非IncP-6的变体。在推定^*oriV^*区域内鉴定出两个串联取向、间隔约142 bp、核苷酸序列相似性76.8%的iteron重复序列；与已知IncP群共有iteron缺乏可检测同源性，提示该复制子可能具有独特的进化起源。

质粒pM27181缺失衍生物的构建：通过^*Bam^*HI片段与卡那霉素抗性盒连接生成的缺失衍生物在^*E. coli^*与^*P. putida^*中均保留复制能力，提示该复制子可能具有广宿主范围。限制性图谱与测序在所有克隆中鉴定出6642 bp与990 bp两个保守片段，所得重组质粒命名为pEBNT-1-K并用于后续实验。根据注释，所得缺失衍生物含有预测编码复制与动员所需蛋白的基因以及若干功能未知的开放阅读框，包括可能为复制所必需的^*rep^*基因（YFW62793）以及编码松弛酶（YFW62792）与动员蛋白（YFW62791）的基因。为构建含在^*E. coli^*与^*P. putida^*中复制所需最小元件集合的质粒，采用随机连接法，从pEBNT-1-K扩增候选区域片段：片段1（2205 bp）含推定复制起点与^*rep^*，片段2 Km（990 bp）含卡那霉素抗性盒，片段3（808 bp）与片段4（724 bp）编码功能未知的假定蛋白，片段5（2471 bp）含推定动员基因。扩增片段连接后转化^*E. coli^* DH5α并在含卡那霉素（50 μg/mL）琼脂上选择，获得8个重组克隆；电泳分析显示其中7个质粒变体表观大小相同，而克隆8的质粒较小。选取大小相同的变体之一命名为pEBNT-2、较小的变体命名为pEBNT-3进行后续分析。PCR在pEBNT-2中检测到片段1，而在pEBNT-3中未检测到片段1、3、4、5对应的扩增子；两质粒均经Sanger测序验证，比较序列分析显示pEBNT-3在扩增区域内（位置178–590，^*rep^*基因下游，GenBank登录号PZ511715）丢失了一个iteron，在缺失区域未发现任何已知的复制与分离稳定性必需元件，该缺失解释了pEBNT-3中片段1无法扩增的原因。^*P. putida^* PCL1760细胞经电穿孔转化，所有变体均获得卡那霉素抗性菌落，表明缺失衍生物在^*E. coli^*与^*P. putida^*中均保留复制能力。

质粒缺失衍生物分离稳定性的评估：在^*E. coli^*中，携带pEBNT-1-K的细胞比例从62%逐渐下降至第六次传代时约30%；相比之下，pEBNT-2与pEBNT-3在整个实验过程中维持较高保留率（71–99%）。三个变体在^*P. putida^*中的稳定性均低于^*E. coli^*，降幅最大者为pEBNT-2（从9%降至0.4%）与pEBNT-3（从35%降至0.1%）；pEBNT-1-K相对更稳定，第六次传代时约10%细胞保留质粒。

qPCR测定质粒拷贝数：野生型菌株^*E. coli^* LJ110与^*P. putida^* PCL1760经缺失衍生物转化，在含卡那霉素的丰富培养基中培养（^*P. putida^* PCL1760另加氨苄青霉素），以qPCR测定质粒拷贝数。携带pEBNT-2的^*P. putida^* PCL1760生长较慢（μ≤0.1），慢于携带pEBNT-1-K（μ≈0.28）或pEBNT-3（μ≈0.23）的细胞；相比之下，携带三个变体的^*E. coli^*生长速率相近；所有^*P. putida^*培养物均较相应^*E. coli^*培养物生长慢。在^*E. coli^*中，pEBNT-1-K与pEBNT-2相对拷贝数最高，约为每染色体当量一个拷贝，而pEBNT-3拷贝数约低两倍，因此pEBNT-3中丢失一个iteron与^*E. coli^*中拷贝数显著下降相关。所有变体在^*P. putida^*中的相对拷贝数均低于^*E. coli^*，宿主依赖性下降最大者为pEBNT-2，其在^*P. putida^*中的拷贝数较^*E. coli^*低13倍以上。

缺失变体从^*E. coli^*向^*P. putida^*细胞接合转移能力的评估：在pM27181缺失衍生物从^*E. coli^*向^*P. putida^*细胞接合转移实验中，使用携带确保菌毛形成与质粒DNA转移的^*tra^*基因的供体菌^*E. coli^* S17-1时，pEBNT-1-K变体能够以2.6×10^?8的效率转移；相比之下，在所测试条件下未检测到pEBNT-2或pEBNT-3的转移。

讨论与结论

讨论部分指出，pM27181编码复制起始蛋白、由松弛酶与辅助动员蛋白组成的动员模块、IS110家族转座酶及若干功能未知的假定蛋白，未鉴定出与抗生素抗性、毒力或次级代谢相关的基因；具有类似组织的质粒已在^*Francisella^*物种与^*Aeromonas salmonicida^*中描述，并被提出可作为获取可移动遗传元件（尤其是转座子）的适应性平台。注释的^*xer^*C基因编码蛋白与^*Pseudomonas^* sp. JUb52的XerD高度相似（319个氨基酸残基中266个即83%一致，无插入或缺失），支持其归属XerC/XerD家族位点特异性酪氨酸重组酶，并提示可能在dif/cer位点重组与质粒多聚体解离中发挥作用；^*S. stutzeri^* DIA-8、^*P. putida^* PCL1760与^*E. coli^* LJ110的染色体均含^*xer^*C与^*xer^*D，质粒编码的XerC样蛋白可能在这些宿主中与染色体XerD相互作用，从而可能改善细胞分裂过程中的质粒遗传。pM27181上CsrA相同蛋白与PrrB/RsmZ家族非编码RNA共存提示一个推定调控模块，该体系在多种细菌中转录后调控基因表达并影响糖原分解代谢、生物膜形成与运动性；尽管隐秘质粒上存在调控基因看似意外，但此类模块可能为宿主提供潜在适应性益处，若在适当条件下发挥功能，可能促进对环境胁迫的响应。采用序贯缺失策略鉴定在^*E. coli^*与^*P. putida^*中复制所需的最小元件：^*Bam^*HI酶切后与卡那霉素抗性盒连接获得pEBNT-1-K（6647 bp），含^*rep^*、编码松弛酶与动员蛋白的动员基因及若干未知功能基因，该构建体在两宿主中均复制，表明其含有自主复制所需元件；进一步经随机连接缩减获得pEBNT-2与pEBNT-3，测序显示pEBNT-3为pEBNT-2缺失^*oriV^*中一个iteron的衍生物。两个微型复制子在两宿主中均保持复制能力，提示最小化复制模块由^*rep^*与至少一个iteron组成；丢失第二个iteron未废除复制，但以宿主依赖方式影响拷贝数控制与分离稳定性，这与若干质粒（包括IncP质粒）中多个iteron精细调节拷贝数、且至少一个功能性iteron可支持复制起始的报道一致。pM27181的遗传组织与可动员质粒一致：缺乏编码T4SS与VirD4/TraG（接合转移所需）的基因，但携带自身动员模块；此类质粒不能介导自身接合转移，但可利用相容辅助元件的转移机器。接合实验证实pEBNT-1-K可从携带^*tra^*基因的^*E. coli^* S17-1转移，而未检测到pEBNT-2或pEBNT-3的转移，与动员基因YFW62792和YFW62791的缺失一致；该模块的丢失限制了通过接合的递送，但可能降低重组构建体不受控传播的风险。pM27181 Rep蛋白（YFW62793）由457个氨基酸残基组成，含翼状螺旋WH2亚类C端HTH DNA结合结构域，该结构域为^*Pseudomonas^*质粒Rep蛋白特征并有助于特异性识别^*oriV^* iteron；归属WH Rep超家族与大多数IncP群Rep蛋白的结构保守性一致，而IncP-6 Rep蛋白结构域组织不同。未发现与共有DnaA结合序列完全匹配者；仅含^*rep^*与含iteron区域及选择盒的构建体在两宿主中均保留复制能力，因此在所测试宿主中复制不需要额外的质粒编码基因。无选择压力下的存续是质粒载体的重要特性，三个缺失衍生物的分离稳定性因遗传结构与宿主而异：在^*E. coli^*中pEBNT-2与pEBNT-3在六次无选择传代中稳定性最高（71–99%细胞保留质粒），而携带动员基因及假定蛋白基因的pEBNT-1-K携带细胞比例从62%降至约30%；这一模式值得注意，因为多拷贝质粒的稳定性常与拷贝数正相关，而pEBNT-1-K、pEBNT-2与pEBNT-3在^*E. coli^*中的相对拷贝数分别为0.97±0.16、0.89±0.08与0.53±0.07，pEBNT-1-K较高的拷贝数并未转化为更高的分离稳定性，一种可能解释是其额外遗传模块带来的负担超过了较高拷贝数的益处，其他质粒体系的类似发现提示稳定性取决于拷贝数与代谢负担两方面。三个变体在^*P. putida^*中连续传代的稳定性均低于^*E. coli^*，损失最大者为pEBNT-2与pEBNT-3：携带pEBNT-2的细胞比例从第一次传代后约9%降至第六次传代后约0.4%，pEBNT-3则从约35%降至不足0.1%；生长速率也显示携带不同变体细胞的差异。这些宿主依赖性模式可能与^*P. putida^*中相对质粒拷贝数较低有关：pEBNT-2约为每染色体当量0.09、pEBNT-3约为0.15，这些群体平均值低于每染色体当量一个质粒拷贝，低质粒丰度可能增加细胞分裂过程中质粒丢失的可能性并有利于无质粒细胞的积累。pEBNT-1-K在^*P. putida^*中相对拷贝数最高（约0.36）且保留率最高，六次传代后约10%。pEBNT-2的宿主依赖性拷贝数下降最大，其在^*P. putida^*中较^*E. coli^*低13倍以上，提示去除未知功能基因可能损害质粒在^*P. putida^*中的维持或复制，其产物可能与宿主特异性因子相互作用并稳定复制复合体，这与辅助蛋白可影响质粒宿主范围的报道一致。比较iteron数目不同的pEBNT-2与pEBNT-3揭示了宿主依赖性效应：在^*E. coli^*中，pEBNT-3丢失一个iteron导致相对pEBNT-2拷贝数约下降1.5倍，而连续传代中分离稳定性未见显著影响，携带三个变体的^*E. coli^*生长速率相近；在^*E. coli^*中单个iteron足以支持pEBNT-3复制，尽管拷贝数降低。携带pEBNT-2的^*P. putida^*在含卡那霉素肉汤中生长速率最低，这些发现提示iteron可能同时影响假单胞菌中的拷贝数控制与分离稳定性。pEBNT-3相对pEBNT-2在^*P. putida^*中拷贝数更高，可能反映丢失一个iteron后负反馈的减弱。对宿主依赖性行为的一种可能解释是^*E. coli^*提供辅助起始因子，补偿Rep对单个iteron结合减少或DnaA依赖性起始步骤，而^*P. putida^* PCL1760中缺乏等效活性或效力较低；该假设尚待验证。其他穿梭质粒中已描述^*oriV^*结构具有宿主特异性要求，其复制效率取决于Rep、iteron与细胞因子之间的相互作用。质粒拷贝数也是载体选择的重要考量：较低拷贝数可降低代谢负担，并可能改善遗传稳定性与实验可重复性，尤其在长期实验以及表达对宿主造成显著负担的蛋白（如膜蛋白）时。荧光假单胞菌所用载体报道的拷贝数为每细胞5–21个，本研究所开发的微型复制子相对拷贝数更低，为克隆载体及难以生产（因对宿主造成负担）蛋白的表达系统提供了潜在基础。

结论部分译文：一个宿主中的高质粒稳定性并不保证其在另一宿主中稳定，即使复制得以保留；因此载体优化需在考虑宿主特异性复制与分离因子的同时平衡拷贝数与代谢负担。拷贝数是分离稳定性的重要但非唯一决定因素，多聚体形成、主动分配系统与胞内宿主因子也可影响遗传。本研究表征了来自^*S. stutzeri^* DIA-8的可动员质粒pM27181，鉴定出由^*rep^*与含iteron区域组成的最小化复制模块；Rep蛋白可能代表IncP超家族中一个此前未表征的谱系。所得衍生物pEBNT-2与pEBNT-3在^*E. coli^*与^*P. putida^*中均复制，为穿梭载体开发提供了基础。动员基因的缺失可能降低水平传播风险，尽管其本身并不确立生物安全性。这些构建体拓展了假单胞菌基因工程候选工具的范围。低拷贝数载体还可促进以更接近单拷贝基因相关表达水平分析异源蛋白，支持在近天然条件下研究酶活性、生理功能与调控相互作用。进一步开发应评估新描述复制子与已确立复制起点的相容性，并考察iteron数目如何影响分离稳定性与质粒拷贝数。