奇瓦瓦栎叶提取物及其酚类成分限制荧光假单胞菌在不锈钢表面定植的研究

《Microorganisms》：Quercus chihuahuensis Leaf Extract and Its Selected Phenolic Constituents Limit Pseudomonas fluorescens Colonization of Stainless Steel

　　

荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens）在食品接触表面形成生物膜（biofilm），导致食品加工环境中持续性污染。富含酚类化合物的植物提取物因其抗菌和抗生物膜特性，为控制细菌定植提供了有前景的替代方案。本研究评估了奇瓦瓦栎（Quercus chihuahuensis）叶提取物及其选定的酚类成分的抗菌和抗生物膜活性，同时考察其对群体感应（quorum-sensing，QS）相关表型的影响。此前对叶提取物的液相色谱-质谱联用（LC-MS）分析显示，对香豆酸（p-coumaric acid）、槲皮素（quercetin）和香草酸（vanillic acid）的相对丰度分别为31.81%、13.66%和3.04%。研究人员测定了最低抑菌浓度（MIC）、最低杀菌浓度（MBC）和最低生物膜抑制浓度（MBIC）。以AISI 304不锈钢作为模拟食品接触表面，评估细菌附着和生物膜发育情况；同时，在紫色杆菌（Chromobacterium violaceum）中评估了紫色杆菌素（violacein）产量和群集运动（swarming motility）；在荧光假单胞菌中也评估了群集运动。结果显示，提取物的MIC、MBIC和MBC值分别为5、7和22 mg/mL。在5 mg/mL浓度下，附着细胞计数减少了2.34 log CFU/cm2；最终浮游菌计数仍高于初始接种物参考值，与未处理对照组相比无统计学显著差异。该浓度低于MBC但等于MIC，因此无法推断其具有非生长依赖性活性。在单个酚类物质中，对香豆酸对附着的降低效果最为显著。提取物和酚酸均降低了紫色杆菌素的产量，而提取物和对香豆酸在两种细菌中均显著抑制了群集运动，且这两种效应均在低于各自MIC的浓度下观察到。这些发现证明了针对荧光假单胞菌在不锈钢表面的抗生物膜活性，以及对QS相关表型的改变作用。

研究背景与目的

荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens）是一种嗜冷菌，广泛与冷藏食品（尤其是乳制品）的腐败相关。其在加工环境中的持续存在主要归因于通过群体感应（QS）信号在不锈钢等工业表面形成生物膜（biofilm）的能力。生物膜的形成增强了细菌对环境胁迫和清洁程序的耐受性，同时促进其对食品接触设备的牢固粘附，从而加剧加工线的反复污染。此外，这种持续的定植不仅会导致设备金属表面腐蚀，还会促进胞外酶的产生，缩短食品货架期并破坏感官品质。传统的控制策略（如化学消毒剂和热处理）往往对生物膜内细胞效果有限，因为生物膜基质可保护细胞免受抗菌剂的作用，使得处理后表面可能再次被定植。这些局限性凸显了对替代策略的需求，即靶向表面定植的早期阶段，而非仅依赖杀菌方法。近年来，植物源酚类化合物作为潜在的抗生物膜和抗QS剂受到关注。来自栎属（Quercus）物种的提取物尤其富含酚类化合物，已被报道具有抗菌和抗QS特性。然而，大多数研究聚焦于临床病原体（如铜绿假单胞菌），关于食品相关腐败菌（如荧光假单胞菌）的信息仍然有限。先前对奇瓦瓦栎（Q. chihuahuensis）叶提取物的表征鉴定出其主要的酚类成分包括对香豆酸（p-coumaric acid）、槲皮素（quercetin）和香草酸（vanillic acid）。尽管该提取物已在食品体系中显示出抗氧化活性，但其预防腐败相关细菌生物膜形成的潜力以及对QS相关表型的可能干扰尚未被研究。因此，本研究旨在评估奇瓦瓦栎叶提取物及其主要酚类化合物对荧光假单胞菌在AISI 304不锈钢（模拟食品接触表面）上的抗生物膜活性，并利用生物传感器菌株紫色杆菌（Chromobacterium violaceum）探究该活性是否与QS相关表型的干扰有关。

主要关键技术方法

研究人员采用了微量肉汤稀释法测定最低抑菌浓度（MIC）和最低杀菌浓度（MBC）；通过在不锈钢试片上孵育后超声脱附并平板计数的方法确定最低生物膜抑制浓度（MBIC）；利用平行实验定量附着细胞和浮游活菌数；通过时间序列采样监测附着动力学；采用二甲基亚砜（DMSO）提取后吸光度测量法量化紫色杆菌素（violacein）产量；在半固体琼脂平板上测量迁移直径以评估群集运动（swarming motility）。所有实验均采用完全随机设计，数据以均值±标准差表示，并通过单因素方差分析（ANOVA）结合Tukey多重比较检验进行统计分析。

研究结果

MIC、MBC和MBIC的测定：奇瓦瓦栎叶提取物对荧光假单胞菌的MIC、MBIC和MBC分别为5、7和22 mg/mL。对香豆酸的MIC为1.25 mg/mL，MBIC为6 mg/mL。香草酸的MIC为1.25 mg/mL，但在测试范围内未表现出杀菌活性。槲皮素在评估条件下（最高浓度1 mg/mL）未检测到抑制活性。对于提取物和对香豆酸，MBC值均超过MIC和MBIC值。提取物的MBIC高于MIC，表明在低于杀菌阈值但高于生长抑制阈值的浓度下可实现不可检测的附着，但这并不能建立独立于生长抑制的活性。

附着与浮游活力评估：在5 mg/mL提取物作用下，附着细胞计数从对照组的5.62 log CFU/cm²降至3.28 log CFU/cm²（减少2.34 log），同时最终浮游菌计数保持在初始接种物参考值（6 log CFU/mL）以上，且与未处理对照组无统计学显著差异。对香豆酸在1.25 mg/mL时使附着减少至3.48 log CFU/cm²（减少2.14 log），但其最终浮游菌计数低于对照组，表明种群生长减少可能对其附着响应有贡献。香草酸在2 mg/mL时使附着减少至4.54 log CFU/cm²。所选浓度均低于各自的杀菌阈值，支持在保留活浮游菌群的情况下减少表面定植，但并未确立生长非依赖性活性。

附着动力学：在24小时监测期内，提取物在所有取样时间点均维持了显著较低的附着细胞计数。相比之下，单个酚酸表现出不同的时间模式，包括后期部分恢复。这些轮廓描述了处理暴露期间定植减少的情况，但终点浮游菌计数不能证明在整个动力学实验中生长或活力保持不变。

QS相关表型的减弱：在紫色杆菌中，所有处理均以浓度依赖性方式降低相对紫色杆菌素产量，且在低于MIC的浓度下也观察到显著降低。提取物在3 mg/mL时将产量降至约6%，对香豆酸在0.78 mg/mL时降至约19%，香草酸在1.55 mg/mL时降至近5%。这表明这些处理可影响QS调控的表型，但不能排除细菌生长变化的贡献。在群集运动中，提取物在紫色杆菌中产生最大的抑制作用，在3 mg/mL时完全抑制可检测的群集运动；香草酸在1.55 mg/mL时也完全抑制了群集运动。在荧光假单胞菌中，提取物和对香豆酸在低于各自MIC的浓度下显著降低了群集运动，而香草酸仅在超过其MIC的浓度下才显著抑制群集运动。这些发现与QS相关表型的改变一致，但需要进一步研究确认是否涉及QS信号的干扰。

讨论与结论

讨论部分指出，本研究表明奇瓦瓦栎叶提取物在低于其杀菌阈值的浓度下减少了荧光假单胞菌在不锈钢上的定植。MIC、MBIC和MBC分别为5、7和22 mg/mL，区分了生长抑制、不可检测附着和杀菌终点。平行附着实验提供了额外证据：在5 mg/mL时，提取物将附着细胞计数减少了2.34 log CFU/cm²，同时最终浮游菌计数保持在初始接种物参考值以上，且与未处理对照组无统计学显著差异。这些观察结果支持在无明显浮游菌群净损失的情况下减少表面定植，但不排除相对于对照组的种群生长减少，也未确定定植响应的机制。不同酚类成分间的差异活性提供了额外见解：对香豆酸（相对丰度31.81%）在评估化合物中表现出最强的生长和粘附抑制作用，而槲皮素（13.66%）在评估条件下未检测到抑制活性。香草酸（3.04%）也表现出可测量的抗生物膜活性，但不如对香豆酸显著。时间分析显示，粗提物在整个评估期间维持了持续的定植减少，而单个酚酸在后期出现部分恢复，这暗示了成分间可能的相互作用。在QS相关表型方面，所有处理均显著降低了紫色杆菌的紫色杆菌素产量和群集运动，且在低于MIC的浓度下也有效，这与QS调控表型的改变一致。然而，研究人员强调，这些发现并未建立生长非依赖性活性或因果性的QS介导机制。结论部分翻译如下：奇瓦瓦栎叶提取物在实验室评估条件下减少了荧光假单胞菌在不锈钢上的定植。在5 mg/mL浓度下（低于其杀菌阈值但等于其MIC），提取物在保留活浮游菌群的情况下将附着细胞计数减少了2.34 log CFU/cm²。提取物在整个24小时评估期内维持了减少的定植状态，而所选酚酸则表现出不同的时间响应。在测试的单个化合物中，对香豆酸对附着的降低效果最为显著。紫色杆菌素产量和群集运动的变化提供了QS相关表型改变的补充证据，但生长非依赖性活性和因果性的QS介导机制尚未被确立。