《Microorganisms》：In Vitro Degradation of Uric Acid and Its Precursors by Limosilactobacillus fermentum DF2 Isolated from Salt-Free Pickled Vegetables Produced in Guizhou Province of China
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高尿酸血症（HUA）是一种以血清尿酸（UA）水平升高为特征的代谢紊乱，由嘌呤代谢失调所致。利用乳酸菌（LAB）缓解HUA已引起广泛关注。本研究旨在从中国贵州省传统发酵无盐腌制蔬菜中分离能够降解UA及嘌呤前体的LAB，评价其降解特性，并探究其潜在的代谢机制。研究
高尿酸血症（HUA）是一种以血清尿酸（UA）水平升高为特征的代谢紊乱，由嘌呤代谢失调所致。利用乳酸菌（LAB）缓解HUA已引起广泛关注。本研究旨在从中国贵州省传统发酵无盐腌制蔬菜中分离能够降解UA及嘌呤前体的LAB，评价其降解特性，并探究其潜在的代谢机制。研究人员分离获得一株命名为DF2的菌株，鉴定为发酵乳杆菌（Limosilactobacillus fermentum，L. fermentum）。37 °C、1 h的体外实验显示，DF2菌株可完全降解鸟苷、肌苷和腺苷，而对UA、黄嘌呤、次黄嘌呤、腺嘌呤和鸟嘌呤的降解率分别为1.99%、3.03%、2.17%、3.79%和12.12%。值得注意的是，该菌株可将核苷转化为相应的嘌呤碱基，并在7 h内完全降解鸟苷来源的鸟嘌呤。基因组分析鉴定了DF2基因组（登录号：SAMN62640203）中负责嘌呤代谢的基因，并提出了DF2菌株中UA及其前体的代谢途径。这些发现不仅拓展了降解UA及其前体的微生物资源，也为开发用于控制HUA患者UA水平的微生物制剂提供了依据。
高尿酸血症（HUA）是嘌呤代谢失调导致血清尿酸（UA）水平升高的代谢紊乱，与痛风性关节炎、慢性肾脏病及心血管疾病相关。现有HUA管理主要依赖药物干预和严格低嘌呤饮食，但药物治疗常引起肝肾毒性，严格饮食限制可能导致营养不足且难以长期坚持，因此亟需安全、有效、易推广的HUA预防策略。乳酸菌（LAB）安全性明确，已有多种LAB菌株被报道可降解UA及其前体，如从浆水中分离的Pediococcus acidilactici GR-5、源自酸肉的L. fermentum SR2-6及酸汤来源的Lactiplantibacillus plantarum ST-11等。无盐腌制蔬菜是中国贵州省特有的传统发酵食品，加工中不添加食盐，经2–7天自然发酵而成，但此前尚未有从中分离到降解UA及其前体LAB菌株的报道。为此，研究人员从贵州毕节市及周边县采集32份传统自制无盐腌制蔬菜样品，开展菌株分离筛选、降解能力评价、安全性与益生特性评估及全基因组测序分析，以拓展微生物资源并为开发降UA微生物制剂提供理论框架。
研究采用的主要关键技术方法包括：以MRS和M17培养基结合CaCO3溶钙圈、革兰染色和过氧化氢酶试验筛选推定LAB，经16S rRNA基因扩增测序及BLAST比对鉴定菌种；以PBS体系结合高效液相色谱（HPLC）测定UA及其前体的降解率与降解产物；通过哥伦比亚血琼脂溶血试验和12种抗生素纸片扩散法进行安全性评价，并测定耐酸、耐胆盐、自聚集、细胞表面疏水性和抑菌活性等益生特性；采用NucleoBond?HMW DNA Kit提取基因组DNA，经Fastp质控、Canu组装、Pilon补gap与校正、Prokka基因预测，结合COG和KEGG数据库注释解析嘌呤代谢相关基因。样品来源为2024年12月18日采自贵州毕节市及周边县、以Brassica juncea或Raphanus sativus叶片制作的无盐腌制蔬菜。
3.1 乳酸菌的分离与鉴定：从无盐腌制蔬菜样品中分离获得43株代表性菌株，经革兰染色和过氧化氢酶试验初步鉴定为推定LAB，16S rRNA基因测序表明43株均为LAB，分属6个种：Lactiplantibacillus plantarum（27株）、Lacticaseibacillus paracasei（10株）、L. fermentum（3株）、Enterococcus faecium（1株）、Lentilactobacillus buchneri（1株）和Loigolactobacillus coryniformis（1株）。
3.2 乳酸菌对鸟苷和肌苷的降解：43株LAB在37 °C、1 h对两种嘌呤核苷的代谢能力存在差异，约7%（3/43）的菌株肌苷降解率为75–100%，约12%（5/43）的菌株鸟苷降解率为75–100%；ZX2对肌苷和鸟苷的降解率分别为75%和88%，DF1和DF2对两种核苷的降解率均达100%，据此选取ZX2、DF1和DF2进入后续实验。
3.3 DF1、DF2和ZX2对尿酸及其他前体的降解：三株菌均完全降解腺苷（100%），与对肌苷和鸟苷的降解结果一致；而对嘌呤碱基和UA降解较弱，鸟嘌呤降解率最高（>11%），腺嘌呤、次黄嘌呤、黄嘌呤和UA降解率为0.33%–3.79%。DF2对腺嘌呤（3.79%）和黄嘌呤（2.17%）的降解率略高于DF1（2.67%和1.48%）和ZX2（0.33%和1.43%），故选取DF2进一步研究。
3.4 发酵乳杆菌DF2降解尿酸及其前体的产物：DF2在1 h内完全降解腺苷、鸟苷和肌苷，同时分别生成相应嘌呤碱基腺嘌呤、鸟嘌呤和次黄嘌呤；延长孵育后这些碱基被进一步降解，鸟苷来源的鸟嘌呤在7 h后消失，而腺嘌呤和次黄嘌呤降解率较低；UA及其前体降解产物中均持续检出保留时间约11 min的未知化合物（Unk-3）；黄嘌呤被转化为次黄嘌呤（保留时间约14 min）和Unk-3。
3.5 发酵乳杆菌DF2的安全性与益生特性：DF2在血琼脂平板上生长良好且无溶血圈，而S. aureus可产生明显溶血圈，表明其无溶血能力；该菌对卡那霉素、万古霉素和氧氟沙星耐药，对红霉素中介，对头孢他啶、氨苄西林、阿莫西林、四环素、氯霉素、克林霉素、林可霉素和复方磺胺甲噁唑敏感。DF2在pH 2.0、3.0、4.0和6.0的MRS肉汤中37 °C孵育3 h后的存活率分别为92.99%、105.83%、129.75%和137.58%；在含0.1%、0.2%和0.3%胆盐的MRS肉汤中存活率分别为9.67%、5.62%和4.59%，随胆盐浓度升高而下降；自聚集率随时间增加，8 h达19.98%；细胞表面疏水性以氯仿最高（11.67%），乙酸乙酯次之（9.75%），二甲苯最低（6.08%）；无细胞上清对Escherichia coli和Staphylococcus aureus的抑菌圈分别为16.96 mm和16.60 mm。
3.6 发酵乳杆菌DF2的基因组测序与特征：其基因组由约2.0 Mbp的环状染色体（GC含量51.3%）和约11.8 kbp的质粒（GC含量39.65%）组成，共预测1914个编码基因，其中染色体1905个、质粒9个；COG分类以L类（复制、重组和修复）最丰富，其次为E类（氨基酸转运与代谢）和J类（翻译、核糖体结构与生物发生）；KEGG注释显示代谢相关通路基因最多，尤以碳水化合物、氨基酸和核苷酸代谢为主；基因组已上传NCBI，登录号为SAMN62640203。经KEGG和COG注释分别鉴定出94个和87个核苷酸代谢相关基因，31个基因编码的酶映射至KEGG嘌呤代谢通路，其中13个酶与嘌呤核苷代谢相关。
讨论部分指出：DF2无溶血活性，安全性良好；其对万古霉素、卡那霉素和氧氟沙星的耐药性可能为Limosilactobacillus属的固有特征，且耐药基因位于染色体而非质粒，水平转移风险低。DF2在pH 2.0下存活率92.99%，高于多数发酵食品来源LAB，耐酸性优良，但在0.1%胆盐中存活率仅9.67%，低于其他发酵食品筛选的LAB；自聚集率和疏水性提示其黏附能力可能有限，实际定植效果需进一步验证；无细胞上清对两种致病菌呈中等抑菌活性。DF2对腺苷、鸟苷和肌苷的快速代谢能力与已报道的L. fermentum菌株BX-59、2Y-15、CM33和H3260相当，其基因组中编码核苷转运蛋白（EC 7.-.-.-）和嘌呤核苷水解酶（EC 3.2.2.1）的基因可能介导核苷跨膜转运及水解为相应嘌呤碱基；由于嘌呤碱基的肠道吸收低于嘌呤核苷，该降解作用可能在体内显著减少UA生成。DF2对腺嘌呤、次黄嘌呤和黄嘌呤降解率仅0.33–3.79%，可能与其基因组缺乏这些碱基进一步分解代谢的基因有关，尽管存在编码嘌呤–胞嘧啶和尿嘧啶/黄嘌呤通透酶的转运基因；其对鸟嘌呤降解活性相对较高（1 h为12.12%），可能与鸟嘌呤脱氨酶（EC 3.5.4.3）基因有关，该酶催化鸟嘌呤脱氨生成黄嘌呤，而鸟嘌呤体外实验中5 h内未检出黄嘌呤，可能是鸟嘌呤和黄嘌呤经磷酸核糖转移酶（EC 2.4.2.22和EC 2.4.2.8）补救合成鸟苷一磷酸。微生物UA降解存在两条主要途径：一是尿酸氧化酶将UA转化为尿囊素，再经尿囊素酶和脲酶分解为氨、CO2和水；二是部分厌氧菌中由xdhD、ygeX、ygfK、ssnA和hyuA等基因编码的酶将UA降解为短链脂肪酸等终产物。本研究中DF2体外3 h后转化UA为黄嘌呤的能力较弱，且其基因组未鉴定到与UA转化相关的已知基因，该活性可能归因于非特异性酶反应或未知旁路代谢途径；UA及其前体降解产物共有的Unk-3峰随降解时间丰度增加，其结构及形成途径有待今后研究。研究局限性在于：所有降解和益生特性表征均为体外实验，DF2的体内降尿酸功效尚待确认；基因组分析预测的嘌呤代谢基因尚未进行功能验证，需进一步开展动物实验和分子验证。
结论译文：本研究从中国贵州省产无盐腌制蔬菜中分离获得能够降解UA及其前体的L. fermentum DF2，并考察了该菌株对UA及其前体的降解能力。体外降解实验表明，DF2菌株在1 h内完全降解鸟苷、肌苷和腺苷，而对UA、黄嘌呤、次黄嘌呤和腺嘌呤的降解率较低。进一步分析揭示，DF2菌株将嘌呤核苷转化为相应的嘌呤碱基，且鸟苷生成的鸟嘌呤在7 h内被完全分解，无黄嘌呤积累。基因组测序与分析鉴定了DF2基因组中与嘌呤核苷代谢相关的基因，为该菌株高效体外降解嘌呤核苷及相应碱基提供了遗传基础。最后，提出了DF2菌株对UA及其前体的代谢途径。这些发现为DF2菌株开发降低UA水平、预防高尿酸血症的微生物制剂提供了理论依据，但其功效与安全性仍需进一步的体内研究予以确认。
