基于gD蛋白单克隆抗体与红色乳胶微球的猪伪狂犬病毒（PRV）双抗体夹心侧向流免疫层析现场快速检测方法

《Microorganisms》：Development of an On-Site Rapid Detection Method for Porcine Pseudorabies Virus Using gD Protein-Based Monoclonal Antibody and Red Latex Microsphere Immunochromatographic Strip

　　

伪狂犬病（Pseudorabies, PR）是一种急性多宿主共患传染病，病原学上由伪狂犬病毒（pseudorabies virus, PRV）引起。作为猪的自然感染，伪狂犬病给全球养猪业造成重大经济损失。此外，自2017年以来由PRV引起的跨物种人感染的出现，突显其先前被低估的人兽共患威胁和公共卫生意义。本研究旨在建立一种创新的双抗体夹心侧向流免疫层析（double-antibody sandwich lateral flow immunoassay, DAS-LFIA），用于PRV gD蛋白的快速检测。首先，制备重组PRV gD蛋白用于小鼠免疫，随后筛选并分离PRV特异性单克隆抗体（monoclonal antibodies, mAbs）。为建立DAS-LFIA，研究人员选择并优化配对抗体。mAb-9B11与红色乳胶微球（red latex microspheres, LMs）偶联，作为检测探针。同时，靶向PRV-gD的mAb-2F6A11和葡萄球菌蛋白A（Staphylococcal protein A, SPA）分别固定于硝酸纤维素膜（nitrocellulose membrane, NC膜）上，作为检测（T）线和质控（C）线。所建立的DAS-LFIA表现出高度特异性，对常见猪病原体或其他PRV编码糖蛋白gB、gC和gE未检出交叉反应。此外，DAS-LFIA表现出高分析灵敏度，对gD蛋白的目视检测限（visual limit of detection, vLOD）为0.31 ng/μL，可在5 min内获得目视判读结果。由于其操作简便、周转快速和分析灵敏度，DAS-LFIA构成一种实用且稳健的工具，适用于资源受限环境中PRV的即时监测，对遏制养猪业PRV传播和降低相关公共卫生风险具有重要价值。

研究背景与意义：伪狂犬病（Pseudorabies, PR）是临床上和经济上影响养猪业的重要传染病之一，其病原为伪狂犬病毒（pseudorabies virus, PRV）。猪是PRV的自然宿主，感染可呈临床型和潜伏型，并造成生殖、呼吸和神经系统病理损伤；妊娠母猪可表现为流产或死胎，2周龄内仔猪感染后几乎全部死亡，给养猪业造成重大经济损失。尽管部分国家通过疫苗接种和根除计划成功在家猪群中消除PRV，但阿根廷（2019）、法国（2020）和墨西哥（2020）的再暴发提示当前防控框架仍存在风险。中国自2011年后出现可逃逸传统Bartha-K61疫苗免疫的II型变异株，河北2017—2018年分离的11株PRV均为II型变异株，且与2019年人急性脑炎相关hSD-1/2019株高度同源；2017年首次记录PRV跨物种感染人，提示其公共卫生风险曾被低估。现有实验室诊断主要包括实时荧光定量PCR（real-time fluorescent quantitative PCR, RT-qPCR）、环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification, LAMP）、重组酶聚合酶扩增（recombinase polymerase amplification, RPA）等分子生物学方法，以及乳胶凝集试验（latex agglutination test, LAT）、间接酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA）、阻断ELISA和间接免疫荧光试验（indirect immunofluorescence assay, IFA）等血清学方法；这些方法特异性和敏感性较高，但存在检测时间较长、依赖专用仪器和熟练操作人员等限制，难以满足基层现场实时检测需求。因此，发展即时检验（point-of-care testing, POCT）平台对PRV早期防控具有重要意义。侧向流免疫层析（lateral flow immunoassay, LFIA）是最常用的POCT平台之一，双抗体夹心（double-antibody sandwich, DAS）模式可提高检测特异性；与胶体金相比，彩色乳胶微球（latex microspheres, LMs）具有更大的比表面积和更高的羧基密度，可提高抗体负载量和分析灵敏度。PRV gD蛋白由独特短区US6基因编码，是病毒进入宿主细胞所必需，可结合细胞表面受体并介导细胞—病毒膜融合；gD序列高度保守，缺失后病毒完全丧失感染性，且是中和抗体的主要靶点，因而适合作为免疫诊断靶标。基于此，研究人员筛选针对PRV gD的高亲和力mAbs，并建立红色LMs基DAS-LFIA，用于PRV现场快速检测。

关键技术方法（不超过250字）：采用CHO/gD细胞系表达纯化重组PRV gD蛋白；免疫BALB/c小鼠，取脾细胞与SP2/0融合，经间接ELISA筛选、有限稀释亚克隆获得mAbs，并用IFA、斑点ELISA、棋盘滴定及同型/亲和力鉴定；将mAb-9B11偶联红色LMs，mAb-2F6A11和SPA分别包被NC膜作T线与C线，组装DAS-LFIA并优化封闭液、LM浓度和探针用量；以PRV、gD、gB/gC/gE及常见猪病毒评价特异性与广谱性，以倍比稀释和ImageJ评价灵敏度并与DAS-ELISA比较。样本来源：HeNL/2017株（GenBank accession No. MT775883）及其重组PRV-GFP由Prof. Wang Hanzhong惠赠，其他病毒和细胞为实验室保存；未涉及临床样本队列。

研究结果：3.1 PRV gD蛋白的表达、纯化与鉴定：通过哺乳动物表达系统表达、离心和亲和层析纯化，SDS-PAGE显示纯化gD蛋白纯度为91%，蛋白印迹（Western blot）显示其与抗His标签抗体反应，ELISA显示免疫小鼠效价范围为1.2×10⁴～5.1×10⁴，表明获得了可用于后续免疫的gD蛋白。3.2 单克隆抗体的制备：完成细胞融合与亚克隆后，对mAbs进行筛选和鉴定。3.2.1 配对抗体的筛选：通过细胞融合和反复亚克隆获得5株分泌抗gD mAbs的阳性杂交瘤，纯化mAbs效价为1:512,000～1:1,024,000，IFA显示5株mAbs均与PRV特异反应。3.2.2 抗体对的选择：将5株mAbs分别进行酶标记并以棋盘滴定配对，以gD蛋白和完整PRV为抗原，根据最高阳性/阴性（positive-to-negative, P/N）OD₄₅₀比值，选择mAb-2F6A11为捕获抗体、mAb-9B11为检测抗体。3.2.3 mAbs的特性：通过同型鉴定、非竞争ELISA、斑点ELISA和广谱反应性试验，确定mAb-2F6A11为IgG2b/Kappa、mAb-9B11为IgG2a/Kappa，亲和常数分别为3.76×10¹² L/mol和9.6×10¹¹ L/mol；两株mAbs特异识别PRV和gD，不与gB、gC、gE及猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）、猪流行性腹泻病毒（PEDV）、猪δ冠状病毒（PDCoV）、猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）、猪轮状病毒（PoRV）交叉，并广谱识别HeNL/2017、Bartha-K61、SA215、HB98、HB2000等PRV株。3.3 试纸条参数优化：通过比较不同封闭液、LM浓度和9B11-LMs用量，确定10% BSA、10%脱脂奶粉和5%酪蛋白封闭效果最佳，2 mg/mL LM（对应25 μL初始微球）及2 μL 9B11-LMs为较优条件。3.4 试纸条性能评价：3.4.1 试纸条的特异性与广谱性：通过检测PRV细胞培养物、gD、gB、gC、gE及常见猪病毒，试纸条仅对PRV细胞培养裂解物和纯化gD显色，不与gB、gC、gE及上述常见猪病毒交叉；对HeNL/2017、Bartha-K61、SA215、HB98、HB2000均检出，表明其特异性和广谱性。3.4.2 试纸条的灵敏度：通过gD蛋白倍比稀释（20～0.16 ng/μL）和PRV HeNL/2017上清1:2～1:128稀释，目视vLOD为0.31 ng/μL，PRV在1:32稀释（约50 TCID₅₀/mL）检出；ImageJ半定量分析将检测限提高至0.16 ng/μL和1:64稀释（约25 TCID₅₀/mL）；DAS-ELISA对gD蛋白检测限为0.63 ng/μL，对PRV在1:32稀释（约50 TCID₅₀/mL）检出，显示试纸条较DAS-ELISA更敏感。

讨论部分总结：讨论指出，PRV作为全球流行的高危猪病原，不仅造成养猪业经济损失，还可跨物种传播并具有公共卫生威胁；中国II型变异株削弱Bartha-K61疫苗效果，因此需要快速、准确的诊断工具支持免疫防控。与ELISA、qPCR、表面等离子共振（surface plasmon resonance, SPR）及等温扩增等方法相比，DAS-LFIA在操作简便性、检测速度和现场适用性方面具有优势；等温扩增虽简化核酸检测，但存在气溶胶污染风险。红色LMs较传统胶体金具有更大的比表面积和更高的羧基密度，有利于提高抗体偶联容量和信号稳定性；双抗体夹心策略通过mAb-2F6A11和mAb-9B11靶向gD，可降低非特异结合。gD在病毒进入、早期表达、免疫原性和序列保守性方面适合作为诊断靶标，且不同PRV分离株gD氨基酸序列差异较小，支持其作为广谱检测靶标。本研究获得5株抗gD mAbs，其中2株高亲和力mAbs用于试纸条开发，并广谱识别野毒株、经典疫苗株和变异疫苗株。与DAS-ELISA平行比较，目视和ImageJ半定量结果一致，数字分析可部分补偿裸眼判读主观性，但绝对定量仍需专用读条仪，目视判读仍是现场应用的主要评价标准。局限性包括：样本垫处理液未系统优化，缺少优化样本垫和干燥保护剂限制长期存储稳定性；血清或组织匀浆的高黏度和复杂蛋白组成可能导致NC膜非特异吸附、背景升高或假阳性，pH和离子强度变化也可能干扰抗原—抗体结合；尚未开展加速老化、批间重复性和猪临床加标样本验证；交叉反应评估仅限所选猪病原和PRV糖蛋白。未来将优化样本垫配方以提高长期稳定性和基质耐受性，开展加速老化、批间重复及临床样本验证；所获mAbs还可用于区分感染与疫苗接种动物（differentiating infected from vaccinated animals, DIVA）检测（尤其结合抗gE试纸条）、多重侧向流系统以及亚单位疫苗定量和质量控制。

研究结论译文：总之，研究人员成功开发了一种用于PRV抗原检测的快速免疫层析方法，适合基层使用。该试纸条与其他流行猪病无交叉反应，具有高特异性、灵敏性和易用性，适合资源有限地区PRV的快速现场检测。该技术为PRV野毒感染早期现场诊断提供了实用工具，对猪场疫病防控具有重要价值。