球孢白僵菌（Metarhizium robertsii）侵染对草地贪夜蛾（Spodoptera frugiperda）细胞免疫的抑制及体液抗菌反应的增强

《Microorganisms》：Genomic Surveillance and Phylogenetic Characterization of Seasonal Human Coronaviruses in Kazakhstan

　　

草地贪夜蛾（Spodoptera frugiperda）是一种全球分布的农业害虫。罗伯茨绿僵菌（Metarhizium robertsii）是一种昆虫病原真菌（EPF），在草地贪夜蛾生物防治中具有较大应用潜力。然而，迄今尚无关于罗伯茨绿僵菌与草地贪夜蛾免疫系统相互作用的研究报道。本研究考察了罗伯茨绿僵菌对草地贪夜蛾的致病性，并证明该真菌对害虫表现出高毒力。罗伯茨绿僵菌感染诱导草地贪夜蛾血细胞凋亡与坏死，进而降低循环血细胞数量。真菌感染还损害了浆细胞（plasmatocytes）的铺展能力。这些对血细胞的不利影响共同导致宿主细胞免疫反应显著受抑，包括吞噬作用（phagocytosis）、结节形成（nodulation）和包囊作用（encapsulation）。同时，罗伯茨绿僵菌感染上调血细胞中酚氧化酶原（prophenoloxidase，PPO）基因表达，导致宿主血淋巴酚氧化酶（phenoloxidase，PO）活性显著升高。真菌侵染后脂肪体中抗菌肽（antimicrobial peptide，AMP）基因转录亦增加。这些体液抗菌反应相关基因的上调增强了血淋巴的抗菌活性。本研究揭示了罗伯茨绿僵菌与草地贪夜蛾免疫相互作用的机制基础，并加深了对昆虫病原真菌致病机制的理解。

草地贪夜蛾（Spodoptera frugiperda）为世界性重大农业害虫，自入侵中国后已扩散至20余个省份，长期依赖化学农药防治带来生态与健康风险，微生物防治成为重要替代途径。罗伯茨绿僵菌（Metarhizium robertsii）寄主谱广、毒力强，具备防治草地贪夜蛾的应用潜力，但该菌与草地贪夜蛾免疫系统的互作机制此前尚无报道，制约了真菌毒力提升与田间应用优化。基于此，研究人员通过浸渍与血腔注射两种方式接种罗伯茨绿僵菌，系统评价其对草地贪夜蛾幼虫的致病性及对细胞免疫与体液免疫的调控作用。研究显示，真菌侵染以时间与剂量依赖方式致死幼虫，注射接种较浸渍接种致死更快；感染显著抑制结节形成、吞噬与包囊等细胞免疫，并降低浆细胞铺展能力；同时血细胞总数及颗粒细胞（granulocytes）、浆细胞数量下降，伴随血细胞凋亡与坏死率升高及凋亡相关基因转录上调；与之相反，感染增强了血淋巴酚氧化酶活性与对Escherichia coli、Staphylococcus aureus的抗菌活性，并上调PPO基因与AMP基因转录。该研究阐明了罗伯茨绿僵菌抑制细胞免疫、激活体液抗菌反应的免疫互作机制，为提升真菌致病力及优化其生物防治应用提供了理论基础。

关键技术方法：以罗伯茨绿僵菌菌株ARSEF 2575（由安徽农业大学惠赠）对草地贪夜蛾三龄幼虫进行分生孢子浸渍处理、对六龄幼虫进行血腔注射，记录死亡率并绘制生存曲线；采用E. coli诱导的体内结节形成试验、Sephadex DEAE A-25微珠包囊试验、FITC标记E. coli的体外吞噬试验及浆细胞长度测定评估细胞免疫；采用YO-PRO-1/碘化丙啶（PI）双染检测血细胞凋亡与坏死；测定血淋巴PO活性及对E. coli、S. aureus的抗菌活性；以Rpl32为内参基因进行逆转录定量PCR（RT-qPCR）检测免疫相关基因表达。

研究结果：（1）罗伯茨绿僵菌侵染降低草地贪夜蛾存活率。浸渍与注射两种接种方式均显著降低幼虫存活率，死亡率随分生孢子浓度升高而增加，1×10⁹ conidia mL^?1浸渍8天内累计死亡率达68%，每头注射1×10⁵与1×10⁴个分生孢子分别在84 h与108 h达100%死亡；据此选用每头1×10⁴个分生孢子用于后续试验。（2）罗伯茨绿僵菌侵染损害细胞免疫。感染幼虫结节数量在12、24、48 hpi均显著减少，吞噬能力在24与48 hpi受抑，包囊指数在各检测时间点均显著降低，浆细胞长度在48 hpi显著缩短，表明真菌感染干扰浆细胞铺展并削弱细胞免疫能力。（3）罗伯茨绿僵菌侵染减少血细胞数量。感染显著降低血淋巴总血细胞数，颗粒细胞在12与48 hpi明显下降，浆细胞在各时间点均显著减少；YO-PRO-1/PI双染显示感染幼虫血细胞凋亡率在12、24、48 hpi显著升高，坏死率在48 hpi显著升高；Caspase-2在三个时间点均显著上调，Cathepsin-like在24与48 hpi显著升高，Caspase-1与p53在12与24 hpi下调、48 hpi显著升高，证实感染触发血细胞凋亡与坏死从而导致循环血细胞减少。（4）罗伯茨绿僵菌侵染增强体液抗菌反应。感染幼虫血浆PO活性在24与48 hpi显著升高；对E. coli与S. aureus的抗菌活性在12 hpi无变化，而在24与48 hpi显著增强，表现为细菌菌落数明显减少。（5）罗伯茨绿僵菌侵染增强免疫相关基因表达。PPO1与PPO2转录在各时间点均显著上调；四种AMP基因（Gallerimycin、Attacin、Lebocin、Gloverin）在12 hpi表达不变或轻度降低，在24与48 hpi强烈上调，提示血淋巴抗菌活性增强既源于PO活性升高，也与AMP丰度增加有关。

讨论部分总结：研究人员指出，注射接种绕过表皮穿透屏障，故致死更快，且六龄幼虫体型较大可提供足量血淋巴用于免疫检测；与近缘种M. rileyi抑制棉铃虫（Helicoverpa armigera）细胞免疫的报道一致，本研究显示罗伯茨绿僵菌损害多种细胞免疫过程，浆细胞铺展能力下降可能是包囊与结节受抑的原因之一，而不同宿主、菌株或取样时间可导致细胞免疫结果差异。血细胞数量是昆虫免疫能力的核心决定因素，真菌通过诱导凋亡与坏死造成血细胞耗竭；昆虫病原真菌可分泌核糖毒素等细胞毒性因子，且血细胞参与脂肪体AMP基因诱导的系统免疫信号。研究人员据此提出罗伯茨绿僵菌通过减少血细胞数量与损害铺展能力的联合策略抑制细胞免疫，铺展受损机制是否涉及细胞骨架破坏尚待研究。与细胞免疫受抑相反，感染增强体液抗菌反应，AMP基因上调与Drosophila melanogaster中GNBP3识别β-1,3-glucan激活Toll通路诱导Drosomycin等报道相符；AMP上调机制尚不清楚，研究人员前期提出M. rileyi可能通过上调AMP清除逃逸入血淋巴的肠道细菌以避免其与真菌竞争营养，该机制是否适用于罗伯茨绿僵菌有待验证。PO活化受真菌与宿主种类共同影响，如Beauveria bassiana通过卵孢菌素抑制宿主PPO活化，而本研究显示罗伯茨绿僵菌触发草地贪夜蛾PPO级联。研究人员亦指出，研究仅以E. coli与S. aureus评价免疫反应，肠道共生菌及真菌感染后细菌易位的影响仍需进一步研究。

结论译文：本研究采用幼虫浸渍于分生孢子悬液与直接血腔注射两种接种方式，考察了罗伯茨绿僵菌对草地贪夜蛾的致病性，并全面评价了该真菌感染对草地贪夜蛾细胞免疫与体液免疫的调控作用。机制分析揭示真菌侵染后宿主体液抗菌反应发生显著改变，关键抗菌肽基因与PPO基因转录显著上调。上述发现加深了对罗伯茨绿僵菌与昆虫宿主分子互作的理解，阐明了真菌感染的核心致病机制，为开发提升真菌致病力、加速感染进程的高效策略提供了有价值的信息，并为优化罗伯茨绿僵菌作为草地贪夜蛾可持续治理中有前景的生防制剂的应用奠定了理论基础。