《Plants》：Occurrence, Epidemiological Aspects and Multilocus Sequence Typing of Pear Decline Phytoplasma in Southern Italy
采用视觉症状评估与基于核糖体DNA（rDNA）定向引物的PCR检测，并结合限制性片段长度多态性（RFLP）分析，对意大利南部相邻的Campania、Basilicata和Calabria三个地区多个梨种植区（包括此前未调查区域）梨衰退（PD）植原体的发生情况进行更新与扩展研究。在所有被检症状梨树以及调查梨园中捕获的63份梨木虱Cacopsylla pyri混合样本中的46份中检出PD植原体。所调查梨园中PD发病率介于10%至65%之间。在嫁接于BA29榅桲砧木的症状梨树上观察到严重PD症状。对aceF、pnp、imp和secY基因序列进行多位点序列分型（MLST）分析，显示意大利南部30份所选PD植原体感染样品间存在相当大的遗传变异。pnp和secY基因观察到的基因型数量最多（各5个），而所研究样品间最高序列差异值15.1出现在aceF基因。就每个所检基因而言，最常鉴定的基因型分别为A24、P4、I40和S13。所检测到的多位点谱与'Ca. Phytoplasma pyri'与'Ca. Phytoplasma prunorum'之间可能发生种间重组的假说相符，尽管混合感染、优先扩增和PCR介导的重组等替代解释未被排除。从所选样品中获得15个不同的多位点谱，并利用相似性网络与先前发表的谱进行比较。这些发现扩展了对意大利南部PD植原体多位点多样性的认识。
梨衰退病（pear decline，PD）是栽培欧洲梨（Pyrus communis）最具破坏性的虫媒和嫁接传播病害，在北美和欧洲各梨产区广泛分布，可造成重大作物损失以及敏感砧木上植株的矮化和死亡。该病最早于1948年在加拿大不列颠哥伦比亚省报道，随后沿太平洋海岸扩散；意大利早在1908年即观察到被称为"梨moria"的类似衰退紊乱，1961年美意联合研究证实其与北美梨衰退病相同，因此PD可能起源于欧洲并随P. communis品种和砧木传入美洲。该病曾极具灾难性，1959至1962年间在加利福尼亚毁灭超过100万株梨树，1944至1947年间在意大利北部Trentino-Alto Adige毁灭逾63000株梨树；近年来在台湾、阿塞拜疆、黎巴嫩、伊朗、土耳其、白俄罗斯、智利、阿根廷、约旦和以色列等地亦有记录。
植原体为柔膜菌纲（Mollicutes）专性胞内细菌，系统侵染植物韧皮部筛管分子，由韧皮部取食的同翅目昆虫在自然界中传播，不能通过汁液传播，但可在苗圃嫁接繁殖中无意传播。由于无法在无菌条件下培养，植原体分类不可避免基于系统发育特征，目前主要依据16S rDNA序列分析归入暂定属'Candidatus Phytoplasma'，该属包含39个分类组（16Sr组）及若干亚组和58个正式描述的'Candidatus Phytoplasma'种。对多个PCR产物测序或对若干持家基因进行MLST分析，似乎是进行更精细菌株区分并深入研究植原体遗传变异与系统发育关系最有前景的工具之一，当16S rDNA序列差异低于1.35%阈值时，该分析可为赋予植原体种级地位提供支持数据。
PD由'Ca. Phytoplasma pyri'引起，属于苹果增生（apple proliferation，AP）植原体组即16SrX组、亚组16SrX-C。该病原与AP组其他成员系统发育上密切相关，尤其是'Ca. Phytoplasma mali'和'Ca. Phytoplasma prunorum'（分别为AP和欧洲核果黄化（ESFY）病害的病原），以及桃黄叶卷（PYLR）植原体和台湾衰退日本梨中鉴定的植原体（PDTW）。在多数采用核糖体和非核糖体DNA序列的研究中，'Ca. Phytoplasma pyri'被证明与PYLR病原无法区分，两者差异见于imp基因；PYLR植原体被视为'Ca. Phytoplasma pyri'的一个亚型，亦称PD/PYLR植原体。'Ca. Phytoplasma pyri'在rDNA序列水平上较为均一，但在aceF、pnp、imp和secY等保守性较低的非核糖体基因中观察到相当大的遗传多样性；MLST分析显示部分西班牙、阿塞拜疆和意大利分离物携带'Ca. Phytoplasma prunorum'的某些基因，支持两分类单元间存在种间重组。
'Ca. Phytoplasma pyri'已在P. communis、P. pyricola、P. ussuriensis、P. calleryana、P. elaeagrifolia和榅桲（Cydonia oblonga）自然感染树中观察到，并可通过嫁接传播至大量Pyrus物种，因此所有Pyrus物种均可能是PD病原的寄主；此外，PCR方法还在自然感染的欧洲榛（Corylus avellana）、桃（Prunus persica）、油桃、扁桃（P. dulcis）、甜樱桃（Prunus avium）及单子叶山楂（Crataegus monogyna）中检出PD植原体。通过木虱取食，'Ca. Phytoplasma pyri'已从病梨树传播至长春花（Catharanthus roseus），并经菟丝子（C. odorata）桥接传播至长春花继而传播至烟草。与AP组其他果树植原体一样，该病原由Cacopsylla属物种自然传播：北美由C. pyricola传播，欧洲报道的媒介为C. pyricola、C. pyri、C. pyrisuga和C. bidens，其中C. pyri被确定为包括意大利在内的一些南欧国家的主要媒介；C. bidens在约旦和以色列亦为PD病原媒介。PD症状表达很大程度上取决于砧木和病害阶段，一般可区分速衰、慢衰和常伴卷叶的叶红化三种综合征。
PD病此前已基于症状评估、使用组特异性核糖体引物的PCR检测及PCR扩增16S rDNA序列的RFLP分析，在意大利南部相邻的Campania、Basilicata、Calabria和Apulia地区报道；1997年秋在Basilicata受PD影响梨树中记录的少数PD植原体分离物已通过16S rDNA基因或16S rDNA与多种较不保守基因的序列和系统发育分析加以检验，但关于意大利南部PD植原体与昆虫媒介关系的信息尚属空白。因此，本研究旨在通过视觉症状评估和PCR检测更新并扩展对意大利南部选定梨种植区PD发生的认识，鉴定Campania三个受影响梨园采集的梨木虱种类，评估这些昆虫中PD植原体DNA的存在情况，并通过MLST分析阐明PD病原的遗传变异。
研究结果显示，病梨树症状与其他地理区域先前描述相似，主要包括慢衰和叶红化综合征的典型症状：受害树无顶端生长或顶端生长减少，叶片少、小、浅绿且革质，边缘略上卷，此类叶片在夏末异常变红并于秋季过早脱落；病树活力低、开花不规律，坐果和果径受损，叶红化常伴卷叶，即叶片自尖端向中脉向下卷曲而边缘沿纵轴向上卷曲。观察期内多株严重受害梨树死亡，部分慢衰病树在每年7、8月异常炎热干燥天气下突然萎蔫死亡。严重受害树根系较健康树缩小。各梨园发病株数从Sibari附近梨园（Sib园）的10%（1980株中198症状株）到Battipaglia附近梨园（Bat 1园）的65%（830株中540症状株）不等；Bat 2园和Pontecagnano Faiano园（Pont园）发病率亦高，分别为62%（2015株中1250症状株）和58%（927株中535症状株）；其余梨园中，Caserta园（Cas园）为12%（4223株中507症状株），Paterno园（Pat园）为22%（2668株中586症状株），Grumento Nova园（Gru园）为18%（1020株中184症状株）。发病率在2023—2025年整个调查期内评估和监测，上述数据在调查期末即2025年9—10月的最终评估中得到确认。
2024—2025年通过黄色粘虫板在Campania地区Battipaglia（Bat 1和Bat 2园）和Pontecagnano Faiano（Pont园）三个受害最重梨园共采集640头梨木虱；2024年在Bat 1、Bat 2和Pont园分别采集104、98和153头，2025年在相同梨园分别采集84、79和122头。所有捕获木虱经形态学鉴定均为Cacopsylla pyri，未记录到其他Cacopsylla属物种。尽管每年总诱捕日数均为3952（Bat 1、Bat 2和Pont园分别为1064、1824和1064），木虱每年均从9月持续采集至10月中旬；春季和夏季仅采集到少量或无木虱，原因或为这些季节针对梨木虱、苹果蠹蛾和蚜虫等相关梨害虫施用杀虫剂，或为夏季异常炎热。
PCR分析中，使用核糖体DNA（rDNA）引物对P1/P7、fO1/rO1和fPD/rO1共检测181株症状梨树，均证明受感染；其中25株仅通过巢式PCR检测呈植原体阳性，即以引物对P1/P7所得扩增产物再用AP组特异性引物对fO1/rO1或PD弱特异性引物对fPD/rO1重新扩增。使用引物对P1/P7和fO1/rO1从植原体参考菌株AT、PD1和GSFY1，以及使用引物对fPD/rO1从菌株PD1亦获得预期大小的扩增产物；无症状梨树和健康梨苗（健康植株对照）未获扩增产物。所有仅经巢式PCR检测呈植原体阳性的梨树均重新取样并以PCR复检，与首次检测一样，所有树仅在上述相同引物组合的巢式PCR中呈阳性。在所有植原体阳性树中，茎和根样品均扩增出目标DNA。共检测630头梨木虱即63份混合样本（每份含10头）；因状态严重劣化，640头中10头未进行分子检测。63份混合样本中46份（73.0%）用上述核糖体引物对检测呈植原体阳性，5份仅经巢式PCR呈阳性。阳性混合样本百分比不代表个体感染率，在适当假设下由混合检测获得的估计个体感染概率为12%（95%精确置信区间8.8—16.5%）。本研究所用非核糖体DNA引物对在所有经核糖体DNA引物对检测呈植原体阳性的病梨树和梨木虱样品中均扩增出目标DNA；另有两份梨木虱混合样本经引物对16SR21/16S22检测获得预期大小扩增产物。所有直接或巢式PCR所用的引物对均未从不含DNA模板的反应混合液（阴性对照）和提取空白对照中获得扩增产物；所有经证明植原体阴性的梨树和木虱样品在加入扩增抑制对照后均呈阳性。
PCR产物RFLP分析中，用SspI限制性内切酶消化以组特异性引物对fO1/rO1获得的PCR产物后，AP植原体参考菌株AT的DNA因16S rDNA序列中存在独特限制性位点而被切割；相反，来自病梨树、梨木虱及PD和ESFY植原体参考菌株PD1和GSFY1的相应片段未被该酶切割。当相同核糖体片段用RsaI限制性内切酶消化时，所有病梨树和梨木虱样品及参考菌株PD1和AT显示相同限制性图谱，该图谱与菌株GSFY1不同，后者在扩增序列中显示额外限制性位点。
DNA测序与数据分析中，对意大利南部记录的30份PD植原体感染样品测定并比较了aceF、pnp、imp和secY基因序列，这些样品选自各调查梨园中质量最高、PCR产物最强的样品；其中24份来自PD感染梨树，6份来自C. pyri混合样本。就每个所检基因而言，上述样品彼此比较并与GenBank数据库中已有序列的PD植原体菌株及相关植原体比较。
在所选PD植原体感染样品中鉴定出4种不同的aceF基因型，与Danet等先前从包括意大利在内的多个欧洲国家以及阿塞拜疆和土耳其报道的基因型无法区分，即A24、A10、A12和A8。A24基因型在所研究样品中最常见，出现于7份PD受害梨树样品（PD2866、PD2881、PD2902、PD2973、PD2974、PD2977和PD2994）和5份PD植原体感染梨木虱样品（PD3204、PD3207、PD3211、PD3217和PD3227）；A10基因型见于9份PD受害梨树样品（PD2639、PD2645、PD2882、PD2890、PD2896、PD2897、PD2906、PD2907和PD2934）和1份PD植原体感染梨木虱样品（PD3223）；A12基因型见于PD受害梨树样品PD3025；A8基因型见于7份均来自PD受害梨树的样品（PD2642、PD2799、PD2800、PD2871、PD2886、PD3029和PD3031）。与A24、A10和A12不同，A8基因型对应'Ca. Phytoplasma prunorum'的aceF序列；A8基因型的存在是相应多位点谱的特征之一，这些谱共同与先前报道的'Ca. Phytoplasma pyri'与'Ca. Phytoplasma prunorum'之间可能重组的假说相符，但混合感染、优先扩增和PCR介导的重组未被排除。对应'Ca. Phytoplasma pyri' aceF序列的基因型间aceF序列相似性为94.6%（A12对A24）至99.9%（A10对A24），这些基因型与对应'Ca. Phytoplasma prunorum' aceF序列的A8基因型共享84.9—85.8%的aceF基因序列相似性。基于aceF序列的系统发育分析显示，A12基因型样品PD3025与参考菌株PD-(PD2Luca)共同形成独立分支，与其他样品仅远缘相关；A8基因型样品紧密聚类并与A24、A10和A12基因型样品明显分离。
pnp基因序列比较显示，所检30份PD植原体感染样品中存在5种不同基因型，依Danet等先前工作命名为P4、P5、P15、P8和P1。P4基因型在所检样品中最丰富，出现于15份PD受害梨树样品（PD2639、PD2645、PD2800、PD2881、PD2882、PD2886、PD2890、PD2896、PD2897、PD2902、PD2906、PD2907、PD2934、PD2973和PD2974）和1份PD植原体感染梨木虱样品（PD3217）；P5基因型见于4份PD受害梨树样品（PD2866、PD2871、PD3029和PD3031）和5份PD植原体感染梨木虱样品（PD3204、PD3207、PD3211、PD3223和PD3227）；P15和P8基因型分别见于3份（PD2799、PD2977和PD2994）和1份（PD3025）均来自PD受害梨树的样品；P1基因型出现于取自PD受害梨树的样品PD2642。与本研究鉴定的其他pnp基因型不同，P1对应'Ca. Phytoplasma prunorum'的pnp基因。P4、P5、P15和P8基因型间pnp序列相似性为97.9%（P5对P8）至99.8%（P4对P5），这些基因型与P1基因型共享94.3—94.7%的pnp基因序列相似性。pnp基因序列系统发育分析中，P8基因型的PD3025与参考植原体菌株PD-(PD2Luca)紧密聚类，并与P4、P5和P15基因型样品以及P1基因型的PD2442明显分离，后者与'Ca. Phytoplasma prunorum'参考菌株聚类。
imp基因型中，与先前在西班牙PYLR受害桃树中报道、后由Riedle-Bauer等命名为"I40"的基因型无法区分的基因型见于13份PD受害梨树样品（PD2639、PD2645、PD2799、PD2800、PD2866、PD2881、PD2882、PD2890、PD2907、PD2973、PD2974、PD2977和PD2994）和5份PD植原体感染梨木虱混合样本（PD3204、PD3207、PD3211、PD3217和PD3227）；Danet等先前报道的imp基因型I27和I20分别见于9份PD受害梨树样品（PD2871、PD2886、PD2896、PD2897、PD2902、PD2906、PD2934、PD3029和PD3031）和1份PD植原体感染梨木虱样品（PD3223），以及2份PD受害梨树样品（PD2642和PD3025）。I40、I27和I20基因型间imp基因序列相似性为89.4%（I27对I20）至92.3%（I40对I27）。imp基因序列系统发育分析显示，I20基因型的样品PD2642和PD3025与参考菌株PD-(PDSpa2)紧密聚类，形成与其他所检样品仅远缘相关的独立谱系；所有I40基因型样品与菌株PD-(THA-14)、PYLR-(Mass1)和PD-(PD33Lib)聚类，并与I27基因型样品明显分离。
secY基因序列水平上，所检材料中鉴定出5种不同基因型。S13基因型最初在斯洛文尼亚PD植原体菌株中描述，见于16份PD受害梨树样品（PD2639、PD2645、PD2799、PD2800、PD2871、PD2882、PD2886、PD2890、PD2897、PD2902、PD2906、PD2907、PD2934、PD2994、PD3029和PD3031）和1份PD植原体感染梨木虱混合样本（PD3223）；secY基因序列与S13基因型相同的PD植原体菌株PD1、LV72和Po2此前已在意大利检出，但这些菌株尚未正式归入任何secY基因型。来自PD受害梨树（PD2866、PD2881、PD2973、PD2974和PD2977）和PD植原体感染梨木虱（PD3204、PD3207、PD3211、PD3217和PD3227）的各5份样品显示与PD植原体菌株DSM和Po1相同的secY基因序列，后者此前在Sicily受PD影响梨园中检出；在延续和扩展Danet等与Pav?i?等采用的secY基因型分类基础上，本研究建议将所有这些实体归入secY基因型S18。Pav?i?等通过提出新secY基因型即S13至S17扩展了Danet等的分类，但该基因型划分在近期一项旨在对'Ca. Phytoplasma mali'菌株分类的工作中未被考虑。secY基因型S8和S4见于样品PD2642和PD3025，二者均取自PD受害梨树；secY基因型S1见于PD受害梨树样品PD2896。与本研究鉴定的其他secY基因型不同，S1对应'Ca. Phytoplasma prunorum'的secY基因。S13、S18、S8和S4基因型间secY基因序列相似性为96.0%（S13对S8）至99.8%（S13对S4），这些基因型与S1基因型共享92.7—92.9%的secY基因序列相似性。secY基因序列系统发育分析中，归入S13基因型的意大利南部PD植原体感染样品与来自斯洛文尼亚（D55-08）和意大利（PD1、LV72和Po2）的PD植原体菌株紧密聚类，归入S18基因型者与PD植原体菌株DSM和Po1聚类，后者此前在Sicily受PD影响梨园中检出；其余样品PD2642、PD3025和PD2896分属secY基因型S8、S4和S1，各自在系统发育树中形成独立分支。
多位点谱鉴定与串联序列系统发育分析中，所检30份意大利南部PD植原体感染样品共鉴定出15个不同多位点谱。其中谱A10-P4-I40-S13和A24-P5-I40-S18最常见，各出现于5份样品；多位点谱A24-P5-I40-S18和A24-P4-I40-S18同时出现于PD受害梨树样品和PD植原体感染梨木虱样品；谱A10-P5-I27-S13仅见于PD植原体感染梨木虱样品PD3223，其余谱仅见于PD受害梨树样品。本研究所鉴定的所有'Ca. Phytoplasma pyri'谱均与先前发表者不同。基于串联和分区aceF、pnp、imp和secY基因序列推断的系统发育关系显示，所检样品多数谱与参考菌株PD-(A10-P3-I19-S7)和PD14-(A10-P4-I19-S7)聚类，样品PD3025-(A12-P8-I20-S4)和PD2642-(A8-P1-I20-S8)的分支模式与其他样品不同。从所检两份梨木虱混合样本经引物对16SR21/16S22获得的扩增产物线粒体16S rDNA序列，彼此相同且与GenBank数据库中Cacopsylla pyri的序列（GenBank登录号MK039582）相同。
讨论部分指出，本研究采用视觉症状评估和基于rDNA定向引物的PCR检测并结合RFLP分析，更新并扩展了对意大利南部多个梨种植区（包括此前未调查区域）PD病发生的认识。用于PCR检测和鉴定PD植原体及AP组其他果树植原体的通用、组特异性和病原特异性引物已针对核糖体和非核糖体DNA序列设计；扩增rDNA序列的引物因灵敏度令人满意而被广泛使用，但有报道称使用病原特异性引物难以鉴别AP组各种果树植原体尤其是PD病原——为PD植原体特异性检测设计的核糖体引物会交叉扩增其他AP组果树植原体尤其是AP和ESFY病原的DNA，这是因这些分类单元在rDNA序列水平上关系密切；此外，病原特异性引物未能检出PD病原的所有菌株。因此，宜使用能扩增所有AP组果树植原体及其中每种病原所有菌株的组特异性引物，PD植原体的可靠鉴定可通过使用合适限制性内切酶对PCR扩增的16S rDNA进行RFLP分析实现，该方法可将PD病原与AP和ESFY植原体清楚区分。通过采用AP组特异性引物和优先扩增PD植原体16S rDNA片段的引物对进行PCR检测，随后进行RFLP分析，在所有所检症状梨树和所调查梨园捕获的63份Cacopsylla pyri混合样本中的46份中检出PD植原体；然而，181株植原体阳性梨树中的25株（13.8%）和46份植原体阳性昆虫混合样本中的5份（10.9%）仅在巢式PCR后才产生可检测的扩增产物，这可能归因于感染植原体滴度极低及其在所检组织中分布不均等因素。
所检梨园PD发病率不同，Battipaglia和Pontecagnano Faiano附近梨园发病率严重，高比例梨树（65%）似受感染并表现严重症状。在所有所检受影响梨园中，观察到的最特征性症状为叶红化，该症状最早多在7月中旬出现，于夏末和秋季达到高峰；表现明显叶红化症状的病梨树产生强PCR信号和/或经直接PCR检测呈植原体阳性，这清楚表明地上部被入侵病原密集定殖的梨树通常发展出叶红化等特征性症状，与先前发现一致。健康梨树在榅桲砧木上生长时夏末和秋季也可能出现叶红化，提示不亲和问题，但榅桲上健康树的红化在季节中出现时间比PD植原体感染所致红化晚数周；本研究中未观察到榅桲上健康树的红化。尽管速衰综合征在东方砧木P. pyrifolia和P. ussuriensis上以及较小程度上在P. communis砧木上普遍，但本研究中部分慢衰病梨树在异常炎热干燥天气条件下于夏季突然萎蔫死亡；已知这些条件是速衰的诱因，且目前在夏季尤其意大利南部很常见。先前研究表明，德国榅桲砧木上梨树受PD植原体影响较小，归因于榅桲寄主特性差，该砧木中PD植原体滴度低，对通常春季发生的地上部季节性再定殖产生负面影响，因而通常被评为相当抗病；相反，意大利中部和北部多个梨产区发现榅桲砧木上梨树受PD植原体严重影响，这些差异被归因于意大利中部和北部木虱侵染比德国更重，因而意大利中部和北部树冠顶部被反复再感染且比从根部开始再定殖时更严重。本研究中，嫁接于BA29榅桲砧木的梨树观察到严重PD症状，但调查并非为解析树龄、品种、梨园条件、管理措施和媒介丰度的影响而设计，这些因素对观察到的症状严重度的贡献因此仍未明确。
Cacopsylla pyri此前已在Campania及意大利南部其他地区记录，是Campania三个监测梨园中采集到的唯一Cacopsylla物种；63份所检昆虫混合样本中46份（73.0%）检出植原体DNA。该百分比代表阳性混合样本比例，不能解释为感染个体昆虫比例，而估计个体感染概率为12.0%（95%精确置信区间8.8—16.5%）。C. pyri对'Ca. Phytoplasma pyri'的传播能力已在实验中得到确立，包括在意大利。
aceF、pnp、imp和secY基因序列MLST分析数据显示，所检30份意大利南部PD植原体感染样品间存在相当大的遗传变异。pnp和secY基因观察到的基因型数量最多（各5个），而所研究样品间最高序列差异值（5.3%）出现在aceF基因；就每个所检基因而言，最常鉴定的基因型分别为A24、P4、I40和S13，均在PD受害梨树和PD植原体感染梨木虱样品中鉴定到。较少鉴定的基因型为A12、P8、P1、I20、S8、S4和S1，除P8外，这些基因型仅出现于一份梨树样品。鉴定于样品PD2642、PD2799、PD2800、PD2871、PD2886、PD3029和PD3031的基因型A8、出现于样品PD2642的基因型P1和鉴定于样品PD2896的基因型S1，分别对应'Ca. Phytoplasma prunorum'的aceF、pnp和secY基因序列。在被鉴定为'Ca. Phytoplasma pyri'的样品中检出先前在'Ca. Phytoplasma prunorum'中报道的等位基因，与先前被解释为支持可能种间重组的观察一致，但本研究获得的多位点谱并未确证重组；使用所用方法不能排除混合感染、不同位点不同模板的优先扩增和PCR介导的重组，特别是16S rRNA基因RFLP图谱虽与'Ca. Phytoplasma pyri'一致，但并未排除另一植原体物种的次要组分。因此，所观察到的多位点谱应被视为与可能种间重组的假说相符，有待进一步研究确定这些等位基因是否存在于同一植原体基因组内。
在意大利南部记录的30份所选PD植原体感染样品中鉴定出15个不同多位点谱，这些谱与Danet等先前报道者不同，其相似性通过网络可视化；该网络提供分析中所含谱的描述性表示，但不确立其祖先或进化起源，解释还受样品选择和已发表谱可得性的限制。此外，由于昆虫样品以混合样本分析且扩增子直接测序，从这些样品获得的等位基因组合不能明确归属于单个植原体基因组；需要额外取样和解析个体感染的分析来研究所检出植原体的种群结构和进化关系。
材料与方法部分，梨树症状样品于2023至2025年采集，特别是在夏末和秋季叶部症状更明显时，采自不同商业梨园：Battipaglia附近两个梨园（下称Bat 1和Bat 2，分别35和30株）、Pontecagnano Faiano（Pont园，22株）、Caserta（Cas园，19株）（均属Campania地区），Basilicata地区Agri河谷Paterno附近（Pat园，34株）和Grumento Nova附近（Gru园，23株），以及Calabria地区Sibari平原Sibari附近（Sib园，18株）。梨园按常规管理，面积1至5公顷，树龄小于12年，砧木为榅桲BA29，嫁接品种为Etrusca、Coscia和Williams。多数梨树尤其所有仅经巢式PCR检测呈植原体阳性的树在采样期内取样两次复检，并在3年期间持续观察症状发展。发病率按表现PD症状梨树数占各梨园梨树总数的百分比计算，公式为发病率=（症状树数/评估树总数）×100。各调查梨园还随机选取若干无症状梨树纳入研究，采样期与症状树相同，上述各梨园分别采样7、6、5、4、7、5和4株无症状树；防虫温室中保存的健康梨苗作为健康植株对照。此外，使用先前传播至长春花并在此寄主中通过定期嫁接保存的AP植原体参考菌株AT、PD植原体菌株PD1和ESFY病原菌株GSFY1的DNA样品作比较。
木虱采集方面，2024至2025年在Campania地区Battipaglia附近（Bat 1和Bat 2园）和Pontecagnano Faiano（Pont园）三个上述梨园，用黄色粘虫板（24.5×13.5 cm，Biogard，Bergamo，Italy）悬挂于树冠约1.5 m高处采集梨木虱；Bat 1和Pont园各7块、Bat 2园12块粘虫板，自5月中旬至10月中旬每两周或当污物碎屑影响效力时收集更换。将梨木虱从粘虫板上分离、用不同鉴定检索表鉴定、计数并保存于95%乙醇中直至检测植原体感染；物种鉴定基于诊断性形态特征，包括雌雄生殖器形态，使用上述鉴定检索表。
DNA提取与PCR分析方面，从病梨树和健康梨树约1.0 g新鲜组织提取总DNA，按Ahrens和Seemüller先前描述的植原体富集程序处理；新鲜组织包括叶柄、中脉和韧皮部刮取物，后者按Ahrens和Seemüller方法从当季枝条及偶从数年生病茎部分或根制备。梨木虱总DNA按先前描述的CTAB提取程序从每组10头中提取。由于高灵敏巢式PCR检测存在污染被扩增的风险，设置含所有提取试剂的提取空白对照，与真实生物样品相同地经历植物组织或梨木虱提取程序的每一步。PCR分析使用核糖体和非核糖体DNA引物，所有引物及其序列见表S2：通用植原体引物对P1/P7扩增1850 bp片段，从16S rRNA基因5′端延伸至23S rDNA 5′区；引物对fO1/rO1特异性扩增AP组所有果树植原体约1070 bp的16S rDNA片段；引物fPD与rO1组合优先扩增PD植原体约900 bp的16S rDNA片段。巢式PCR中，以引物对P1/P7所得扩增子用引物对fO1/rO1或fPD/rO1重新扩增。扩增非rDNA序列使用以下引物对：AceFf1/AceFr1后接AceFf2/AceFr2，扩增AP组果树植原体aceF基因约790 bp片段；Pnpf1/Pnpr1后接Pnpf2/Pnpr2，扩增AP组果树植原体pnp基因550 bp片段；IMPF2bis/IMPR1bis后接IMPF3pyr/IMPR4pyrA，扩增PD植原体imp基因450 bp片段；SecYMalF1/SecYMalR1后接SecYMalF2/SecYMalR2，扩增AP组果树植原体secY基因约660 bp片段。梨木虱线粒体16S rDNA序列用引物对16SR21/16S22扩增，该引物对扩增约450 bp片段。PCR在50 μL反应混合液中进行，含125 μM四种dNTP、0.5 μM各引物、1 U Dream Taq DNA聚合酶、1×聚合酶缓冲液（均Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA，USA）、5 μL模板DNA（100—200 ng）和水，使用Applied Biosystems VeritiPro 96-Well Thermal Cycler（Thermo Fisher Scientific）仪器；反应混合液经35个循环，条件为95 °C变性30 s、55 °C退火60 s（非rDNA引物为50 °C）、72 °C延伸90 s（引物对fO1/rO1、fPD/rO1及非rDNA引物为60 s），最后72 °C 10 min。巢式PCR以初始扩增所得1 μL PCR产物为模板，在上述反应混合液中进行。所有PCR检测均设不含DNA模板的反应混合液作阴性对照；对经证明植原体阴性的梨树和木虱DNA提取物，通过加入少量用于比较的植原体参考菌株DNA制备物（扩增抑制对照）检测PCR抑制因子存在。5 μL PCR产物在含0.5 μg/mL SYBR Safe DNA凝胶染料（Invitrogen，Waltham，MA，USA）的1.5%水平琼脂糖凝胶中于TAE缓冲液（40 mM Tris-acetate、1 mM EDTA，pH 8.0）电泳分析，DNA条带经ImageQuant LAS 4000系统1.2版（GE Healthcare Bio-Sciences AB，Uppsala，Sweden）可视化。
PCR产物RFLP分析方面，将直接或巢式PCR以引物对fO1/rO1获得的10 μL产物分别用SspI和RsaI限制性内切酶按厂商说明（Thermo Fisher Scientific）消化；5 μL消化产物在TAE中3%水平琼脂糖凝胶和/或TBE缓冲液（45 mM Tris-borate、1 mM EDTA，pH 8）中5%垂直聚丙烯酰胺凝胶上分离，电泳后如上用SYBR Safe DNA凝胶染料可视化，分子量用1 Kb Plus DNA ladder（Thermo Fisher Scientific）测定。
DNA测序与数据分析方面，用引物对AceFf2/AceFr2、Pnpf2/Pnpr2、IMPF3pyr/IMPR4pyrA和SecYMalF2/SecYMalR2从24份PD感染梨树样品和6份植原体阳性C. pyri混合样本获得的PCR产物，用PureLink PCR Purification Kit（Invitrogen）纯化并直接测序；对直接扩增子测序所得序列赋予等位基因命名，其组合记录为样品水平多位点谱。用于测序的扩增子取自各调查梨园中质量最高、PCR产物最强的阳性样品。每条PCR扩增片段双链测序由意大利Padua大学BMR Genomics用PCR分析相同引物完成。所得序列用DNASTAR LaserGene软件7.1版或序列分析软件BioEdit 7.2.5版组装和编辑，然后在NCBI网站进行BLAST 2.17.0版搜索分析；多序列比对用LaserGene软件（DNASTAR）或BioEdit软件的CLUSTAL W完成，序列相似性用LaserGene软件（DNASTAR）的MEGALIGN程序计算。所存序列GenBank登录号如下：aceF为PZ792957至PZ792986，pnp为PZ792987至PZ793016，imp为PZ793017至PZ793046，secY为PZ793047至PZ793076，线粒体16S rRNA基因为QB058825至QB058826。系统发育和分子进化分析用遗传分析软件MEGA 12版采用邻接法参数和自举检验进行，数据重采样1000次，自举百分比值标于树节点；邻接法和最大似然法建树结果相似，MEGA软件中最大似然树分析参数为：替换模型Tamura-Nei、位点间速率均一、ML分析初始树经NJ/MP自动生成、ML启发式方法最近邻互换（NNI）、系统发育检验自举法、自举重复1000次。多位点序列网络通过用goeBURST（global optimal eBURST）算法分析各样品串联aceF、pnp、imp和secY基因序列构建，该算法为eBURST算法的改进，在PHYLOViZ 2.0软件中实现，基于已发表多位点谱和本研究所鉴定多位点谱，克隆复合群（CCs）按单一位点变异（SLV）定义。aceF、pnp、imp和secY基因序列分别比对并用Concatenator软件v. 0.3.1串联后，用IQ-TREE 3.1.4版进行最大似然（ML）系统发育分析；串联比对含四个基因特异性分区，每个基因一个分区，每个分区最佳拟合核苷酸替换模型用ModelFinder按贝叶斯信息准则（BIC）选择，所选模型为aceF的HKY + F + I、pnp的TPM2u + F + I、imp的TPM3u + F + G4和secY的HKY + F + I；应用边连接比例分区模型，允许各分区有单独替换模型和进化速率，同时按比例连接各分区枝长；分支支持用1000次超快自举重复评估，所得系统发育树用iTOL v. 7可视化；单个基因比对、串联分区比对和Newick格式最终树作为补充数据提供。
梨木虱感染率的统计估计方面，用最大似然估计量估计经PCR检测的捕获梨木虱组感染率（p），公式为p = 1 ? H1/k，其中H为阴性混合样本占所检混合样本总数的比例，k为混合样本大小（单管中合并的昆虫数）；95%置信区间先通过获得阳性混合样本比例（46/63）的精确二项Clopper–Pearson置信限，再用p = 1 ? (1 ? q)(1/k)将两限转换至个体水平，其中q为阳性混合样本比例，由此得到8.8—16.5%的95%置信区间。
结论部分指出，本研究记录了在Campania、Basilicata和Calabria选定梨园采样的症状梨树中PD相关植原体的发生；PCR检测结合RFLP分析在所有所检181株症状树中检出'Ca. Phytoplasma pyri'。嫁接于BA29榅桲砧木的树观察到严重症状，但品种、树龄、梨园条件、管理和媒介丰度的相对贡献未予评估。Cacopsylla pyri是Campania三个监测梨园中采集到的唯一物种，所检63份昆虫混合样本中46份植原体阳性；这些发现支持该已确立媒介可能参与当地病原传播，但未直接评估所采昆虫的感染性或传播效率。aceF、pnp、imp和secY多位点分析在30份所选PD植原体感染样品（含24份植物样品和6份昆虫混合样本）中揭示15个不同谱；部分样品产生先前在'Ca. Phytoplasma prunorum'中报道的等位基因，形成与可能种间重组假说相符的谱，但混合感染、优先扩增和PCR介导的重组未被排除，所观察到的等位基因组合不能明确归属于单个植原体基因组；相似性网络描述所检谱间关系而不确立其祖先。这些结果扩展了对所采样梨园中PD发生及所检出多位点多样性的认识。
补充材料包括：图S1为悬挂于梨树冠约1.5 m高处、捕获大量木虱的黄色粘虫板；图S2为意大利南部梨衰退（PD）植原体及苹果增生（AP）植原体组即16SrX组参考植原体菌株16S rDNA片段的巢式PCR扩增示例，使用通用植原体引物对P1/P7后接组特异性引物对fO1/rO1；图S3为意大利南部PD植原体及AP组参考植原体菌株以组特异性引物对fO1/rO1扩增的16S rDNA的RsaI和SspI限制性图谱；表S1为本研究所检与意大利南部梨衰退（PD）植原体相关的植原体；表S2为本研究所用寡核苷酸引物详情；补充数据为单个基因比对、串联分区比对和Newick格式最终树。
关键技术方法概括（不超过250字）：研究于2023—2025年在意大利南部Campania、Basilicata和Calabria三地区7个商业梨园（Bat 1、Bat 2、Pont、Cas、Pat、Gru、Sib园）进行症状评估与发病率调查；2024—2025年在Campania三个受害最重梨园用黄色粘虫板采集梨木虱并作形态学鉴定；采用植原体富集法从梨树组织、CTAB法从梨木虱混合样本提取DNA；以通用、AP组特异性和PD优先性核糖体引物进行直接与巢式PCR，并以SspI和RsaI进行RFLP分析；对aceF、pnp、imp和secY基因扩增子直接测序，用MEGA 12、IQ-TREE 3.1.4、PHYLOViZ 2.0（goeBURST）进行系统发育与多位点谱网络分析；用最大似然法估计木虱个体感染率及精确二项置信区间。
