合成支撑的羟基百里香酚二酯GC–MS/保留指数库及其在植物基质分析中的应用

《Plants》：Synthesis-Supported GC–MS/Retention-Index Library of Hydroxythymol Diesters for Analysis of Botanical Matrices

　　

采用气相色谱–质谱联用（GC–MS）对复杂天然基质中挥发性成分进行可靠鉴定仍具挑战性，尤其当密切相关的区域异构体与酰基同系物呈现相似质谱且保留指数（RI）数据不一致时。本研究旨在建立二酰化羟基百里香酚衍生物的合成GC–MS/RI参考库，并将其应用于Doronicum columnae（菊科）根精油中百里香酚来源成分的表征。该库共纳入49种含异丁酰基、2-甲基丁酰基和异戊酰基残基的羟基百里香酚二酯，覆盖百里香酚骨架六个附加氧化/酰化位置（C-2、C-5、C-6、C-7、C-8和C-9）内全部可及的区域异构组合，其中44种化合物此前未见报道。RI值在统一条件下于非极性DB-5MS柱和极性HP-Innowax柱上测定，化合物经GC–MS表征，并在适用时经核磁共振（NMR）波谱表征。数据集揭示了清晰的结构–保留关系，位置异构对保留的影响强于酰基残基变化。相关性分析与半经验模型酯减除方法揭示了特定区域异构系列内规则的結構–保留趋势。应用合成参考库，辅以双柱RI数据、质谱比对与共进样，实现了D. columnae根精油极性较强馏分中16种二酰化羟基百里香酚衍生物的鉴定，其中12种为首次报道的天然成分。所建立的方法为区分复杂植物基质中百里香酚来源酯类提供了分析框架。

研究背景方面，气相色谱–质谱联用（GC–MS）是分析复杂混合物中挥发性有机化合物的常用技术，但次要成分与结构相关异构体的可靠鉴定仍存在困难，其原因在于这些化合物质谱高度相似、保留特性接近。基于GC–MS的鉴定主要依赖谱库与保留指数（RI）数据，而现有数据常不完整、不一致或在不同实验条件下获得，位置异构体与结构相关异构体的细微结构差异难以在电子轰击（EI）质谱中充分体现，导致复杂天然混合物分析中出现模糊归属与误判。百里香酚衍生物是菊科中广泛分布的含氧单萜类重要类别，尤其在植物地下器官及其精油中常见，Arnica、Telekia、Carpesium、Pulicaria、Helenium等属中已报道结构多样的百里香酚衍生物，包括简单酯、醚–酯及二酰化衍生物。羟基百里香酚二酯通过附加氧化位置与两个酰基残基身份的变化贡献菊科挥发物的结构多样性，但其丰度低、EI质谱高度相似、色谱分离有限且参考数据不完整，常规谱库检索难以鉴定。此外，已发表的分析数据存在矛盾，例如7-异丁酰氧基百里香酚异丁酸酯在不同报道中的质谱模式并不完全一致，可能源于仪器条件、固定相、数据解读或暂定结构归属的差异，凸显了基于合成参考化合物并在非极性与极性固定相上获取可重现色谱数据集的系统研究的必要性。研究人员此前对D. columnae根精油的研究显示，该油以百里香酚异丁酸酯和百里香酚2-甲基丁酸酯为主，次要成分主要为含氧甲氧基对伞花烃衍生物；色谱分离得到富含痕量成分的极性较强馏分，其质谱提示存在其他百里香酚类结构，但仅凭GC–MS无法高置信度归属。尽管C-7与C-9等位置取代的化合物已有报道，但在统一色谱条件下覆盖天然存在的羟基百里香酚二酯全部相关位置异构体的系统参考数据集仍然缺乏，而此类数据集对于建立可靠的结构–保留关系、评价EI质谱的诊断价值以及实现复杂精油基质中相关成分的可靠鉴定至关重要。

基于上述问题，研究人员开展了系统的合成与色谱表征研究。研究设计了一个涵盖三种天然支链酰基残基（异丁酰基、2-甲基丁酰基、异戊酰基）与百里香酚骨架上六个附加氧化/酰化位置（C-2、C-5、C-6、C-7、C-8、C-9）组合的化合物库，并采用贯穿全文的编号与编码系统：百里香酚原有酚羟基连接于C-3，代码后缀3-R表示该酚羟基的酯化，前缀2-R、5-R、6-R表示芳环上的附加酰氧基取代，7-R、8-R、9-R分别表示位于甲基、异丙基叔苄位碳和异丙基侧链末端碳上的酰氧基取代；代码中iPr、sBu、iBu分别指酰基残基RCO–的烷基部分，即iPrCO为异丁酰基、sBuCO为2-甲基丁酰基、iBuCO为异戊酰基。研究人员最终将49种二酰化羟基百里香酚衍生物纳入合成GC–MS/RI参考库，其中44种为此前未描述的化合物，其RI值在非极性DB-5MS柱（RI_a）与极性HP-Innowax柱（RI_p）上测定。据研究人员所知，这是目前在相同色谱条件下分析如此广泛区域异构百里香酚酯类的最全面的统一色谱数据集之一。研究得出结论：位置异构对色谱保留的影响大于酰基残基变化；双(异丁酰)衍生物在两相上的洗脱顺序均为8 < 2 < 9 < 5 < 6 < 7；8-取代衍生物保留指数最低，2-取代类似物紧随其后，9-取代居中，5-、6-尤其是7-取代衍生物保留指数最高；C₅酰基异构体的相对保留在5-、6-、7-、9-取代系列中异戊酰基高于2-甲基丁酰基，而在空间更紧凑的2-和8-取代系列中趋势相反。应用该合成参考库，结合双柱RI数据、质谱比对与共进样，研究人员在D. columnae根精油极性较强馏分中鉴定出16种羟基百里香酚二酯，其中12种为首次报道的天然成分。该研究的重要意义在于，所建立的数据集为精油、草药制剂、食品相关植物基质及其他复杂天然产物中百里香酚来源酯类的未来鉴定提供了有用的分析框架，并表明合成参考物、双柱RI数据、EI质谱与共进样的联合使用能够可靠区分仅凭文献数据无法高置信度鉴定的密切相关的区域异构体与酰基同系物。

在技术方法方面，研究以化学合成为核心，通过多条合成路线制备目标二酯：2-酰氧基百里香酚酯经百里香酚邻位甲酰化后Dakin氧化得到2-羟基百里香酚关键中间体，再经Steglich酯化制备；5-酰氧基系列以地衣酚为起点，经乙酰化与Fries重排、格氏反应及氢化得到5-羟基百里香酚；6-酰氧基系列由百里香氢醌经Steglich酯化制备；7-酰氧基系列基于7-羟基百里香酚的选择性酯化；8-酰氧基系列由8-羟基百里香酚经氢化钠去质子化后以酰氯直接酰化；9-酰氧基系列经间甲酚与乙酰乙酸甲酯的Pechmann缩合、碱开环脱羧得到8,9-脱氢百里香酚，再经硼氢化–氧化得到9-羟基百里香酚后酯化。结构表征采用核磁共振（NMR）波谱（¹H、¹³C、COSY、NOESY、gHSQC、gHMBC、DEPT）、高分辨质谱（HRMS）、红外光谱（FTIR）、紫外–可见光谱（UV–Vis）与元素分析。色谱分析采用配备5975B质量选择检测器的Hewlett-Packard 6890N气相色谱仪，分别在DB-5MS柱（30 m × 0.25 mm i.d.，膜厚0.25 μm）与HP-Innowax柱上于规定升温程序下进行，线性保留指数以C₈–C₃₀正构烷烃同系物为参照、按van den Dool与Kratz方程计算，取三次独立进样的整数均值。植物材料方面，所用Doronicum columnae Ten.根精油来源于研究人员此前研究，原植物采自塞尔维亚共和国?ar Mountains野生居群（2021年5月花期），凭证标本保存于塞尔维亚尼什大学理学院植物标本馆（编号HMN-15655），经水蒸气蒸馏获得黄色精油（得率0.56%，w/w），并经硅胶干柱真空色谱得到以10–20%（v/v）乙醚/正己烷洗脱的第12–16份合并的极性较强馏分（共45.8 mg），本研究对该馏分重新进行GC–MS分析。

研究结果方面，首先是参考库的构建与结构证据分级。研究人员通过上述合成策略将49种二酰化羟基百里香酚衍生物纳入参考库，其中44种为此前未描述化合物。参考库条目所依据的结构证据水平不同：C-8系列中仅8-iPr-3-iPr经NMR分离并表征，其余六个条目依据合成来源、色谱行为与EI-MS行为归属为合成混合物组分；部分仅为GC–MS分析制备的衍生物及C-2共洗脱对的复合谱亦作类似区分；在所研究馏分的天然成分中未归属任何C-8衍生物，用于天然成分归属的参考结构由核磁数据支持。

其次是保留指数与结构–保留关系。研究人员在DB-5MS与HP-Innowax两柱上测定了全部二酯的RI值，发现位置异构对色谱保留的影响大于酰基残基变化：异丁酰基被相应的C₅同系物（2-甲基丁酰基或异戊酰基）取代一般仅引起RI中度增加，而第二个酰氧基取代位置的改变常导致RI_a与RI_p显著位移。双(异丁酰)衍生物在两相上的洗脱顺序均为8 < 2 < 9 < 5 < 6 < 7，其他酰基组合呈现大致相似的模式，但出现若干反转与近重合，说明取代位置与酰基身份共同影响保留；该趋势在极性差异明显的固定相上持续存在，表明保留主要由分子内在结构特征而非单纯疏水性决定。研究人员据此提出，色谱行为主要取决于两个酯官能团的空间排布与整体分子几何：8-取代衍生物RI最低，2-取代类似物紧随其后，二者两个酯基空间邻近，可能促进更紧凑的分子构象并部分屏蔽酯官能团，从而减少与固定相的相互作用；9-取代衍生物保留居中，可能反映酰氧基甲基侧链更大的构象柔性；5-、6-尤其是7-取代衍生物RI最高，其酯基空间上更为分离与暴露，增加了可用于分子间相互作用的有效分子表面，7-取代衍生物的高保留还可能与苄位酯侧链兼具构象柔性与高度可及的酯官能团有关。关于两种C₅酰基异构体的相对保留，在5-、6-、7-、9-取代系列中异戊酰基衍生物RI一般高于相应的2-甲基丁酰基类似物，而在更紧凑的2-和8-取代衍生物中趋势相反，2-甲基丁酰基化合物一致晚于相应的异戊酰基类似物洗脱；这种反转提示酰基链分支的影响强烈依赖于两个酯基的空间排布，并在空间受限的区域异构系列中尤为明显，α-分支的2-甲基丁酰基残基在两个酯官能团空间邻近时对分子形状影响更大。

第三是半经验模型酯减除分析。研究人员以适当的单酯模型化合物的RI值从相应羟基百里香酚二酯的实验RI值中减去，得到与第二个酰氧基取代相关的残余保留指数增量（ΔRI_individual = RI_diester ? RI_model），并计算了按酰氧基位置、酰基残基与色谱柱分别统计的平均残余增量。尽管RI并非严格可加，计算所得平均残余增量在若干区域异构系列内表现出相当程度的规律性，因此相关二酯的预期RI可用RI_est = RI_model + 平均残余增量近似；当存在两个互补模型酯时可获得两个互补RI估计值，二者的一致性为结构归属的可靠性提供了额外指示。研究人员进一步计算了各单个残余增量与相应均值的偏差（δΔRI），正值表示高于均值、负值表示低于均值。5-、6-、7-、9-取代系列的偏差相对较小，表明残余增量在这些组内基本可迁移；2-和8-取代衍生物的偏差较大，与其更紧凑、空间受限的分子排布一致，此类系列中两个酯官能团空间邻近可能增强构象与空间效应，使各酰氧基的保留贡献较少独立于分子其余部分。因此，模型酯减除方法对更伸展的5-、6-、7-、9-取代衍生物最为可靠，对2-和8-取代系列的RI估计应更谨慎解读。研究人员强调，该方法并非替代合成参考化合物、双柱RI数据、EI-MS比对或共进样，而是当完整参考覆盖不可用时为评估暂定归属提供合理性筛选，RI观测值与由模型酯增量导出的估计区间的一致性可作为羟基百里香酚二酯GC–MS鉴定的附加而非独立标准。

第四是双柱相关分析。研究人员发现，全部合成二酯在极性柱上的RI值与在非极性柱上所得RI值总体强相关，表明一般保留行为在不同固定相间基本保持，但相关性并不完美，说明HP-Innowax并非仅以恒定偏移重现DB-5MS洗脱模式，而是提供额外的结构区分。按单个区域异构系列分别考察时，RI_a–RI_p相关性很高，说明酰基残基变化在两柱上以大致平行的方式影响保留；2-、5-、6-取代系列规律性最强，7-、8-、9-取代衍生物偏差略大，可能反映分子几何、构象柔性与酯官能团对极性固定相可及性的差异。各区域异构系列间的两两相关显示，5-、6-、7-、9-取代衍生物构成最规则的子集，在DB-5MS柱上相互相关性很高，R²一般高于0.99，表明这些更伸展的区域异构框架内酰基残基的同系变化产生近乎平行的保留趋势；HP-Innowax柱上亦观察到类似关系，但偏差略大，尤其涉及7-取代系列的相关性。2-取代衍生物与5-、6-、7-、9-取代系列的相关性较弱但仍有意义，该效应在DB-5MS柱上中等，在HP-Innowax柱上更明显，与2-取代衍生物两个酯官能团的紧凑邻位排布一致。8-取代衍生物在DB-5MS柱上亦与若干其他系列高度相关，尤其与6-和9-取代衍生物，但因两种混合8-取代二酯未能获得、可比数据点减少，这些相关性应谨慎解读；在HP-Innowax柱上涉及8-取代衍生物的相关性一般低于DB-5MS柱，提示极性固定相对该系列的独特结构特征更敏感，这与所提出的8-取代衍生物紧凑几何及酯基连接于叔碳原子的情形相符。2-与8-取代系列在DB-5MS柱上亦相互相关，支持两组共享某些与紧凑分子几何相关的保留特征，但HP-Innowax柱上相应相关性较弱，表明其与极性固定相的相互作用并非由完全相同的结构因素支配。总体而言，相关分析证实羟基百里香酚二酯库内的保留行为高度结构化且部分可预测，最强的预测关系见于5-、6-、7-、9-取代衍生物，而2-和8-取代系列显示受控但系统性的偏差，支持采用亚组特异的结构–保留关系而非单一全局相关。

第五是与文献数据的比较。研究人员指出，本研究所鉴定的一些成分在其他菊科精油中有先例，相关的7-和9-取代百里香酚二酯已在Arnica、Telekia与Carpesium中报道，包括7-异丁酰氧基百里香酚异丁酸酯、9-异丁酰氧基百里香酚异丁酸酯及相关2-甲基丁酰氧基衍生物；但这些报道在色谱条件与各归属可用的证据方面存在差异，限制了成分列表的直接比较。文献比较初步提示的暂定归属仅作初步处理，文献数据与本研究的比较显示RI值存在明显差异：例如7-异丁酰氧基百里香酚异丁酸酯、9-异丁酰氧基百里香酚异丁酸酯、9-(2-甲基丁酰氧基)百里香酚异丁酸酯与9-异戊酰氧基百里香酚异丁酸酯此前在非极性CP-Sil 5柱上的RI值分别为1924、1891、1970和1974，而本研究在DB-5MS上测得的相应RI值为1961、1921、2007和2011；极性固定相上亦观察到类似但较小的差异，文献在FFAP上的RI值分别为2556、2483、2561和2576，本研究在HP-Innowax上为2568、2497、2578和2583；将本研究的DB-5MS数据与Telekia和Carpesium精油在Rtx-1MS和DB-1柱上报道的RI值比较时也可见可比但符合预期的差异。这些差异很可能至少部分归因于不同固定相、升温程序与RI校准条件的使用，但其幅度强调仅凭文献RI值不足以高置信度鉴定密切相关的羟基百里香酚二酯，这对常显示相近EI质谱并可能以次要成分出现在复杂精油馏分中的位置异构体与酰基同系物尤为重要。研究人员还观察到7-异丁酰氧基百里香酚异丁酸酯的另一复杂情况：本研究中合成标准品的EI质谱以m/z 166为主导诊断碎片，m/z 149强度明显较低，而Carpesium divaricatum研究中归属为该化合物的谱图以m/z 149为基峰、m/z 166相对强度较低；尽管不能排除仪器条件与数据处理差异，该矛盾也可能提示早期报道中存在共洗脱或密切相关异构体的归属，因此本研究中该化合物在D. columnae馏分中的身份是在合成参考化合物、比较DB-5MS与HP-Innowax双柱RI值、EI-MS匹配及共进样实验之后才得以确立。

第六是天然成分的鉴定。应用合成参考库，研究人员在D. columnae根精油极性较强馏分中鉴定出16种羟基百里香酚二酯，其中12种为首次报道的天然成分，鉴定标准包括与合成参考物的EI-MS比对、保留指数测定与共进样。6-iPr-3-sBu与6-sBu-3-iPr的归属需特别注意，因其合成参考物在DB-5MS上的RI值非常接近（分别为2044和2045），在HP-Innowax上取整后的指数相同（2604）；在未加标的植物馏分中，两个肩峰先于归属为7-sBu-3-iPr的较大峰出现，分别加入经NMR表征的合成参考物后，较早的特征峰（对应6-iPr-3-sBu）与较晚的特征峰（对应6-sBu-3-iPr）得到增强，这些响应支持了部分重叠色谱区内各化合物的归属，但未实现基线分离；二者极为相似的EI质谱与相同的HP-Innowax取整指数被视为支持性信息而非区分两种区域异构体的独立手段。C-7系列涵盖苄位与酚氧原子上异丁酰基、2-甲基丁酰基和异戊酰基残基的全部九种组合，其更大的多样性指已鉴定结构的数量而非相对丰度。结合伴随的C-6与C-9衍生物以及此前报道的百里香酚酯与含氧甲氧基对伞花烃衍生物，这些发现扩展了对所研究D. columnae根油的结构描述，并为未来相关植物材料的比较提供了参考信息。研究人员还说明，先前关于结构及天然存在情况的描述分别通过SciFinder中基于结构的检索（2026年10月23日进行）与相关植物化学文献查阅予以评估，文中“新天然存在”指在这些检索中未发现来自天然来源的早期报道，并不意味着本研究从植物馏分中单独分离出该化合物。

最后是讨论与结论部分。总体而言，本研究建立了羟基百里香酚二酯的全面GC–MS/RI参考数据集，并证明了其在复杂天然基质分析中的实用价值。合成、双柱RI测定、EI-MS比对、共进样与结构–保留分析的结合，使研究人员能够可靠区分仅凭文献数据无法高置信度鉴定的密切相关的区域异构体与酰基同系物。虽然本研究并未直接研究食品样品，但所解决的分析挑战与食品、风味及植物质量控制分析相关，D. columnae精油馏分被用作化学复杂的植物基质概念验证，以展示合成支撑的GC–MS/RI库如何帮助区分风味物质、草药制剂、含精油食品补充剂及其他复杂植物基质中可能遇到的密切相关的百里香酚来源酯类。研究所用植物应用仅限于此前获得的单一采集D. columnae根精油富集馏分，结果涉及所分析材料中归属成分的存在情况，并未确立其在未分级精油中的种群普遍性、季节变异或相对丰度。研究结论为：采用气相色谱–质谱联用（GC–MS）对复杂天然基质中挥发性成分进行可靠鉴定仍具挑战性，尤其当密切相关的区域异构体与酰基同系物呈现相似质谱且保留指数（RI）数据不一致时；本研究旨在建立二酰化羟基百里香酚衍生物的合成GC–MS/RI参考库，并将其应用于Doronicum columnae（菊科）根精油中百里香酚来源成分的表征；该库共纳入49种含异丁酰基、2-甲基丁酰基和异戊酰基残基的羟基百里香酚二酯，覆盖百里香酚骨架六个附加氧化/酰化位置（C-2、C-5、C-6、C-7、C-8和C-9）内全部可及的区域异构组合，其中44种化合物此前未见报道；RI值在统一条件下于非极性DB-5MS柱和极性HP-Innowax柱上测定，化合物经GC–MS表征，并在适用时经核磁共振（NMR）波谱表征；数据集揭示了清晰的结构–保留关系，位置异构对保留的影响强于酰基残基变化；相关性分析与半经验模型酯减除方法揭示了特定区域异构系列内规则的结构–保留趋势；应用合成参考库，辅以双柱RI数据、质谱比对与共进样，实现了D. columnae根精油极性较强馏分中16种二酰化羟基百里香酚衍生物的鉴定，其中12种为首次报道的天然成分；所建立的方法为区分复杂植物基质中百里香酚来源酯类提供了分析框架。