在提高CO2浓度条件下削减钝顶节旋藻（Limnospira platensis）培养基中NaHCO3用量的可行性研究

《Plants》：Investigating the Potential for Reducing Sodium Bicarbonate in the Nutrient Medium for Cultivation of Limnospira platensis at Elevated CO2 Concentration

　　

碳酸氢钠（NaHCO3）在Zarrouk培养基中同时充当主要碳源和碱性缓冲剂，占螺旋藻培养成本的很大一部分。本研究评估了在提高CO2浓度条件下，与大气CO2条件相比，可否降低乃至完全取消培养基中的NaHCO3浓度以培养钝顶节旋藻（Limnospira platensis）。在密闭气室中采用10 L柱式光生物反应器开展了两组连续实验（第一组以3%设定值富集CO2，持续12天；第二组处于大气CO2下，培养至第8天时全部死亡），所用藻株已适应3% CO2。两组实验仅气室气氛不同（3% CO2与大气约0.04% CO2），富集气室的CO2浓度在每次取样后升至约3%，至下次取样前降至约0.5%。每组均测试8个NaHCO3浓度（0–12 g/L，即参考水平12 g/L的0–100%，该参考水平为标准Zarrouk培养基16.8 g/L的71%），3% CO2下每处理设3个平行，大气CO2下设2个平行。监测指标包括生物量、pH、碳酸根与碳酸氢根离子、硝酸盐与磷酸盐消耗以及藻丝活力。在3% CO2下，所有NaHCO3浓度（包括未添加NaHCO3的培养基）均能生长，至第12天生物量达3.59–4.11 g/L（0与0.6 g/L处理较12 g/L对照低7–8%）。pH维持在8.40–9.40，活藻丝比例为92.1–96.3%；藻丝活力在各处理间无显著差异，而pH存在显著差异。在大气CO2下（将适应CO2的接种物直接转入空气），表观pH升至12.75，碳酸氢盐耗尽，0–1.2 g/L NaHCO3处理培养物2天内死亡，3–12 g/L处理至第8天死亡，第6天已无存活藻丝。上述结果表明，在气室气氛CO2富集（设定值3%，平均约1.4%）条件下，12天内无需添加NaHCO3即可生长：生物量中固定的碳来自气相，碳酸氢盐库在原位形成，其碱度主要来源于硝酸盐同化。这提示了一条降低螺旋藻生产培养基成本的可能途径，尚需通过CO2供给与成本分析加以证实。

研究背景与问题：螺旋藻（钝顶节旋藻，Limnospira platensis）因富含蛋白质（占干重60–70%）、维生素、矿物质及必需脂肪酸等而被广泛培养，Zarrouk培养基仍是其标准培养基，其中NaHCO₃同时充当主要碳源与碱性缓冲剂。经典配方中NaHCO₃高达16.8 g/L，既提供碳营养又维持适宜碱性pH，但其成本占培养基成本的最大份额，是限制螺旋藻生物量工业化放大生产的主要因素之一。已有研究尝试以气态CO₂替代NaHCO₃，但关于可允许的减量幅度及其对生长速率的影响，各研究结果差异很大：有研究以NaOH溶液和CO₂完全替代NaHCO₃并使培养基成本降低34.3%而不损害生物量，有研究在仅0.5% CO₂下完全不添加NaHCO₃培养，也有研究发现最大生物量增量出现在8.4 g/L（标准值的一半）而非完全去除时，提示存在最适值而非单调关系；同时另有研究指出高浓度CO₂（9 vol%）会导致细胞大量死亡并降低脂质与蛋白质含量，10% CO₂下比生长速率显著低于不添加CO₂时，且鼓泡式气液交换效率低，CO₂吸收比例仅13–20%。这些分歧部分源于多数研究仅改变单一参数（CO₂浓度或NaHCO₃浓度）且只设若干离散水平，缺乏在同一供气条件下对完整碳酸氢盐浓度梯度的系统比较；此外，已有研究或在大气CO₂下考察NaHCO₃减量，或在提高CO₂下考察但未在同一实验、相同培养条件下直接对比，难以区分碳酸氢盐作为碳源与作为pH缓冲剂的作用。研究人员此前已在密闭气室柱式光生物反应器中证明长期适应高CO₂藻株的CO₂捕集效率与生物量生产，以及同一气室中碳酸盐–碳酸氢盐平衡的动态，本研究在此基础上，在同一实验平台上直接比较CO₂富集气氛（3%设定值）与大气CO₂下、覆盖NaHCO₃全浓度梯度（0至参考水平12 g/L的100%）的钝顶节旋藻生长。

研究内容与结论：研究旨在评估在提高CO₂浓度条件下能否降低乃至完全取消培养基中NaHCO₃，并与大气CO₂下培养作比较；具体任务包括考察不同NaHCO₃浓度下的生物量积累动态、培养基pH与碳酸盐–碳酸氢盐平衡动态、硝酸盐与磷酸盐消耗、显微观察及活/死藻丝比例，并确定在提高CO₂下维持高效生长与高活力所需的最低NaHCO₃浓度或完全取消的可能性。结论表明：在CO₂富集（3%设定值，平均约1.4%）下，钝顶节旋藻在0–12 g/L全部NaHCO₃浓度下均能生长，0与0.6 g/L处理的最终生物量较12 g/L对照低7–8%，而在该实验系统（适应3% CO₂的接种物直接转入空气）中大气CO₂下所有浓度培养物均死亡；这说明在以硝酸盐为氮源的培养基中、单个批次周期内，决定培养物能否生长的是气相CO₂供给而非初始小苏打浓度。其意义在于提示了一条降低螺旋藻生产培养基成本的可能途径，但尚需通过CO₂供给与成本分析加以证实。

关键技术方法：采用12 m³密闭气室，内置24个（第一组，每处理3个平行）或16个（第二组，每处理2个平行）10 L柱式玻璃光生物反应器，连续光照225±20 μmol m^?2 s^?1、27±1 °C，以1 L/min鼓泡通入气室气氛；用多通道气体分析仪连续记录O₂与CO₂；以655 nm光密度结合换算系数计算生物量；pH计测定pH；盐酸滴定法测定碳酸根与碳酸氢根；镁还原–Griess法与钼酸盐法分别测定硝酸盐与磷酸盐；亚甲基蓝染色结合Goryaev计数板显微计数活/死藻丝。藻株Arthrospira (Limnospira) platensis rsemsu P Bios来源于莫斯科国立大学可再生能源实验室菌种保藏，已适应3% CO₂六个月。

研究结果：（1）生长：3% CO₂下各NaHCO₃浓度均稳定生长，第12天生物量3.59–4.11 g/L，最高在6 g/L（4.11±0.22 g/L）与12 g/L（3.91±0.10 g/L），最低在0.6 g/L（3.59±0.12 g/L）与0 g/L（3.65±0.11 g/L）；单因素方差分析显示第12天浓度间差异显著，但Tukey检验仅0.6与6 g/L间显著；NaHCO₃的作用主要是加快初期生长，不存在生长失败的下限浓度。大气CO₂下0–1.2 g/L处理2天内死亡，3–12 g/L处理第2–4天短暂生长后骤降，第8天生物量仅0.14–0.54 g/L，与培养基碱化（pH>12）、碳酸盐平衡向CO₃^2?移动及HCO₃^?完全耗尽一致。（2）pH变化：3% CO₂下pH全程维持在8.40–9.40，第0天随NaHCO₃浓度升高而降低（0 g/L为9.57±0.01，12 g/L为8.82±0.02），第12天差异仍显著，最低在无添加NaHCO₃（8.83±0.04），最高在12 g/L（9.37±0.02），各处理pH趋于8.8–9.4；大气CO₂下第2天pH即升至10.3–12.4，第4–8天达12.75。（3）磷酸盐与硝酸盐动态：3% CO₂下硝酸盐从1148±172 mg/L降至7.4–30.8 mg/L（消耗>97%），磷酸盐从226±45 mg/L降至119–148 mg/L（消耗35–47%），差异均在方法误差范围内，不能确认NaHCO₃的显著影响；大气条件下培养物死亡，未能测定。（4）碳酸盐与碳酸氢盐变化：3% CO₂下碳酸盐动态非单调，第4天下降、第8天回升、第12天再降，第12天随初始NaHCO₃浓度分层（0–0.6 g/L最低65与102 mg/L，12 g/L最高572 mg/L）；碳酸氢盐在各处理中单调增加，第12天达2445–8650 mg/L（40.1–141.8 mmol/L），高浓度各成独立统计组，低浓度（0–1.2 g/L）间无显著差异。大气条件下第4天碳酸氢盐几乎完全消失，碳酸盐计算值显著升高（第4天3、6、9、12 g/L分别为1980±85、1860±85、3240±170、4440 mg/L），但3 g/L处理的计算结果存在无法解释的不一致，需谨慎解读。（5）藻丝活力：3% CO₂下藻丝形态典型完整，第12天活藻丝密度30.5±0.9至34.3±0.8×10⁸/L，死藻丝1.3±1.0至2.8±1.3×10⁸/L，活藻丝比例92.1–96.3%，各浓度间无显著差异；大气条件下第6天藻丝出现空泡与断裂，所有剩余浓度均无活藻丝，活力为0%。

讨论与结论：讨论指出，决定生长的关键因素并非无机碳的形态或供给量，而是系统将pH维持在生理可接受范围的能力；3% CO₂下气相CO₂持续补充使碳酸盐平衡左移、维持足够H⁺浓度，防止光合消耗HCO₃^?引起的碱化。实测pH与气室气体记录结合分析表明，培养物在每个循环末接近与气室空气（约0.4–0.5 vol%）平衡，而非与补充后的3%平衡。碳平衡计算显示，对照（12 g/L）培养基初始无机碳约143 mmol/L，第12天固定的生物量碳约153 mmol C/L，而HCO₃^?+CO₃^2?库并未减少（第12天151 mmol/L），说明进入生物量的碳几乎全部来自气相，添加的NaHCO₃未被消耗；无添加NaHCO₃处理中生物量与无机碳库的增加同样由气相CO₂供给，约相当于每10 L反应器12天1.6–1.7 mol C，为通过鼓泡器CO₂的17–18%，处于文献报道的13–20%吸收效率范围内。碱度平衡显示，无添加NaHCO₃处理中碱度升高约25–30 meq/L，与硝酸盐同化释放的碱度（每摩尔NO₃^?一当量，3.0 g/L KNO₃对应29.7 mmol/L，消耗>97%）相符；所谓“无碳酸氢盐”处理并非严格无碳酸氢盐，除接种物带入的约9 mmol/L（约0.55 g/L）外，碳酸氢盐由气相CO₂与硝酸盐来源碱度在原位生成，故结论适用于以硝酸盐为氮源的培养基。大气条件下的不同表现可由无外源CO₂时平衡右移解释：光合消耗HCO₃^?与硝酸盐同化释放OH^?，而空气鼓泡又 stripping CO₂，大气CO₂溶解过慢无法补偿，pH超过约11–12时培养物死亡；高光强加速CO₂耗竭与pH上升，且接种物经六个月3% CO₂适应后直接转入空气，其高亲和力无机碳吸收系统可能尚未重新诱导。降低NaHCO₃同时使Na⁺从约160降至约17 mmol/L、离子强度从约0.22降至约0.08 mol/L，而蓝细菌主要HCO₃^?转运蛋白（BicA、SbtA）依赖Na⁺，故低浓度下生物量的轻微下降不能排除Na⁺的作用。成本方面，每千克无添加NaHCO₃条件下生产的生物量可省去3.3 kg NaHCO₃，但需固定约1.7 kg CO₂，按13–20%吸收效率计需供给约9–13 kg CO₂；气室记录显示24个反应器共形成约0.87 kg生物量期间加入约95 mol（约4.2 kg）CO₂，即每千克生物量至少约4.8 kg CO₂，其中仅约36%被固定；且各处理中碳酸氢盐均累积，说明CO₂富集下NaHCO₃并未被消耗而仅在培养基弃置时损失，若培养基循环使用则节省更小；研究未开展成本分析，减低成本应理解为潜在而非已证实的收益。研究亦指出低NaHCO₃处理pH为8.40–8.45，略低于最适范围8.5–10.5，CO₂分压升高五倍可使pH下降约0.7单位，低碱度培养基在更高CO₂下可能酸化，且高碱度对开放培养有防污染作用，低碱度下的污染风险及生物量品质（叶绿素a、类胡萝卜素、蛋白质、藻蓝蛋白）尚待评估。研究局限包括：CO₂处理未设重复、与实验批次混杂；接种物适应3% CO₂且无空气适应接种物与全强度Zarrouk对照；第二组每处理仅2个平行、部分指标每处理仅测1个反应器且反应器未随机排列；生物量由单一系数换算；pH>9.18及滴定形态分析为近似值；仅测试一个批次周期；无添加NaHCO₃处理仍含接种物带入的约0.8 g/L NaHCO₃；CO₂浓度呈锯齿状波动，结果不能外推至恒定CO₂水平，应视为原理性验证。

结论部分译文：研究表明，在气相CO₂富集（设定值3%，平均约1.4%）条件下，钝顶节旋藻在全部添加NaHCO₃浓度范围（0–12 g/L）内均能生长，0与0.6 g/L处理的最终生物量较12 g/L对照低7–8%；而在该实验系统（接种物适应3% CO₂后直接转入空气）中，培养物在直至12 g/L的所有NaHCO₃浓度下均死亡。这表明，在以硝酸盐为氮源的培养基中、单个批次周期内，决定培养物能否生长的是来自气相的CO₂供给而非初始小苏打浓度。培养基成本的可能降低仍需通过CO₂供给与成本分析加以证实。未来研究应着重于：测试适应无小苏打培养基的接种物经多次继代培养后的生长，并设置空气适应接种物与全量16.8 g/L培养基对照、重复的CO₂处理及Na⁺平衡（NaCl）对照；评估无碳酸氢盐对生物量生化组成（蛋白质、碳水化合物、藻蓝蛋白、脂质、色素）的影响；研究不同CO₂浓度下无添加NaHCO₃培养基中碳酸盐–碳酸氢盐平衡的动态；并在中试光生物反应器中放大，对取消碳酸氢盐与CO₂供给进行经济评估。