《Plants》：Genome-Wide Identification of the R2R3-MYB Gene Family in Mango and Multi-Omics Analyses Reveal Genes Involved in Anthocyanin Biosynthesis in Fruit Peels of Different Colors
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芒果（Mangifera indica L.）是一种重要的经济热带水果，花青素（anthocyanins）是果皮颜色的关键决定因素。尽管R2R3-MYB转录因子（transcription factors, TFs）已被确认为多种植物花青素生物合成的关键调控因
芒果（Mangifera indica L.）是一种重要的经济热带水果，花青素（anthocyanins）是果皮颜色的关键决定因素。尽管R2R3-MYB转录因子（transcription factors, TFs）已被确认为多种植物花青素生物合成的关键调控因子，但其在芒果中的作用仍鲜有探索。本研究在M. indica基因组中鉴定了370个MiMYB基因，包括194个MiR2R3-MYB基因，这些基因不均匀地分布在20条染色体上。系统发育分析将MiR2R3-MYB基因分为39个亚家族，而基因结构分析揭示了其保守的组织结构。串联重复（tandem duplication）和片段重复（segmental duplication）是该基因家族扩增的主要驱动力，而非同义替换与同义替换比率（Ka/Ks）表明这些基因主要经历了纯化选择（purifying selection）。对红色、黄色和绿色芒果果皮的转录组学分析鉴定了差异表达的MiR2R3-MYB基因和花青素结构基因。此外，在花青素结构基因的启动子中预测到143个潜在的MYB结合位点。整合的转录组学和代谢组学分析揭示了45个差异表达的MiR2R3-MYB基因与36种差异积累的花青素代谢物之间存在显著相关性。基于显著相关的花青素代谢物数量，研究人员选择了8个候选基因进行逆转录定量实时PCR（reverse transcription quantitative real-time PCR, RT-qPCR）验证。值得注意的是，候选基因MiMYB107与最多数量的花青素组分呈正相关。MiMYB107-eGFP融合蛋白的亚细胞定位分析表明其主要定位于细胞核，Western印迹法证实了MiMYB107蛋白的表达。本研究为理解芒果果皮花青素积累的分子机制提供了重要见解。
研究背景与科学问题
果皮颜色是芒果（Mangifera indica L.）果实重要的品质性状，直接影响其市场价值和消费者接受度。果皮颜色主要由花青素（anthocyanins）的积累决定。在众多植物物种中，R2R3-MYB转录因子（transcription factors, TFs）已被证实是调控花青素生物合成的关键调节因子。然而，在芒果中，虽然已有少数MYB转录因子（如MiMYB10、MiMYB33和MiMYB1）被报道参与类胡萝卜素或类黄酮代谢，但针对R2R3-MYB基因家族的全基因组鉴定、进化特征、其与不同果皮颜色表型下花青素代谢物的关联，以及它们对花青素结构基因的潜在调控作用，仍缺乏系统性的研究。因此，研究人员开展了此项研究，旨在通过整合基因组学、转录组学、代谢组学及实验验证，全面解析芒果R2R3-MYB基因家族及其在果皮着色中的潜在功能。
主要关键技术方法
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全基因组鉴定与生物信息学分析：利用HMMER软件基于MYB结构域（PF00249）的隐马尔可夫模型（hidden Markov model, HMM）在‘Alphonso’芒果参考基因组中进行搜索，鉴定MiMYB基因家族成员。随后，使用ExPASy ProtParam、MEGA 11、MEME Suite、PlantCARE、MCScanX、KaKs_Calculator 2.0及OrthoFinder等工具，对蛋白质理化性质、系统发育关系、保守基序、启动子顺式作用元件、基因复制事件、非同义替换与同义替换比率（Ka/Ks）以及共线性进行分析。
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转录组测序（RNA-seq）与RT-qPCR验证：对三种不同果皮颜色的田间种植芒果栽培品种——‘贵妃’（红色）、‘金煌’（黄色）和‘青皮’（绿色）的成熟果皮进行转录组测序，每种设置三个生物学重复。通过DESeq2鉴定差异表达基因（differentially expressed genes, DEGs）。选取8个候选MiR2R3-MYB基因，以MiActin为内参，采用2-ΔΔCt方法进行逆转录定量实时PCR（RT-qPCR）验证。
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靶向花青素代谢组学分析：采用超高效液相色谱-串联质谱（ultra-performance liquid chromatography–tandem mass spectrometry, UPLC-MS/MS）技术，对相同芒果果皮样品进行靶向花青素代谢物检测，并通过正交偏最小二乘判别分析（orthogonal partial least-squares discriminant analysis, OPLS-DA）鉴定差异积累代谢物（differentially accumulated metabolites, DAMs）。
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相关性分析与网络构建：基于Pearson相关系数（|r| > 0.8, p < 0.05），对差异表达的MiR2R3-MYB基因与花青素DAMs进行相关性分析，并使用Cytoscape软件构建基因-代谢物调控网络。
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亚细胞定位与Western印迹验证：将候选基因MiMYB107的编码序列克隆至pBWA(V)H2STMVΩ-eGFP载体，在本氏烟（Nicotiana benthamiana）叶片中瞬时表达，通过激光共聚焦显微镜观察其亚细胞定位，并通过Western印迹法检测融合蛋白表达。
主要研究结果
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2.1 全基因组鉴定与染色体分布：在芒果基因组中共鉴定出370个MiMYB基因，包括194个R2R3-MYB基因。这些MiR2R3-MYB基因不均匀地分布于20条染色体上，其中第9号染色体数量最多（20个），第16号最少（4个）。共发现16对串联重复基因。
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2.2 系统发育分析：通过与拟南芥（A. thaliana）R2R3-MYB蛋白序列构建邻接法系统发育树，将194个MiR2R3-MYB蛋白划分为39个亚家族。其中，S14亚家族成员最多（19个），M9亚家族最少（2个）。部分亚家族（如M1、M6、M13、M14、M15）仅包含芒果特有基因，表明该家族发生了谱系特异性分化。
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2.3 保守基因结构与基序分析：所有MiR2R3-MYB蛋白均含有基序3和4，其中基序3和4位于N端，包含R2和R3 DNA结合域的保守色氨酸残基。R3结构域的第一个色氨酸常被苯丙氨酸替代。基因结构分析显示，大多数MiR2R3-MYB基因（70.1%）含有三个外显子。
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2.4 启动子顺式作用元件分析：启动子区域富含多种与光响应、植物激素信号、胁迫应答及生长发育相关的顺式作用元件，其中光响应元件种类最多（2573个），脱落酸响应元件（ABRE）数量最多（385个）。
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2.5 共线性、Ka/Ks及直系同源分析：共鉴定出1274个基因组内共线性基因对。第3号染色体上的248个重复基因对的Ka/Ks比值均小于0.5，表明这些基因主要受纯化选择。芒果与桃（P. persica）之间的共线性和直系同源基因对数量最多，表明两者间R2R3-MYB基因家族的共线性保守性更高。
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2.6 转录组分析：在红、黄、绿三种果皮中鉴定出49个差异表达的MiR2R3-MYB基因，其表达模式可分为五个簇，表现出品种特异性。
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2.7 花青素结构基因分析：鉴定出38个编码花青素生物合成结构酶的差异表达基因，涉及上游苯丙烷途径、早期类黄酮途径和晚期花青素特异途径。其中，晚期途径的DFR、ANS和UFGT基因在红色果皮中表达量最高。在这些结构基因的启动子区共预测到143个可能的MYB结合位点。
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2.8 差异积累代谢物分析：共鉴定出47种差异积累代谢物，其中42种为花青素，占89.36%。飞燕草素占比最高（25.5%），其次为矢车菊素（23.4%）和芍药素（21.3%）。红色果皮品种中芍药素-3-O-葡萄糖苷、天竺葵素-3-O-半乳糖苷和矢车菊素-3-O-半乳糖苷的含量显著高于其他品种。
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2.9 相关性分析与网络构建：Pearson相关性分析显示，45个差异表达的MiR2R3-MYB基因与36种花青素DAMs显著相关。构建的相关性网络包含81个节点和345条边。MiMYB2、MiMYB115和MiMYB107是连接度最高的基因。其中，MiMYB107与最多数量的花青素（16种）呈正相关（15种）。
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2.10 RT-qPCR验证：对8个候选基因的RT-qPCR验证结果显示，其表达趋势与转录组数据一致。除MiMYB2在黄色品种中表达最高外，其余7个基因均在红色品种中表达最高。
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2.11 亚细胞定位：MiMYB107-eGFP融合蛋白在本氏烟叶片表皮细胞中瞬时表达后，荧光信号主要定位于细胞核，与其作为转录因子的预期定位相符。
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2.12 Western印迹分析：Western印迹检测到大小约为61.6 kDa的特异性条带，与MiMYB107-eGFP融合蛋白的预测分子量一致，证实了该融合蛋白的成功表达。
讨论与结论总结
讨论部分指出，本研究利用高质量芒果基因组，鉴定出194个MiR2R3-MYB基因，数量远超此前报道的54个，这得益于基因组注释质量和鉴定标准的提升。系统发育分析揭示了芒果特有的亚家族，暗示了功能分化。启动子顺式元件分析表明该家族可能受环境、激素和发育信号的共同调控。重复基因对的低Ka/Ks值表明其进化主要受纯化选择约束。转录组与代谢组的联合分析构建了基因-代谢物调控网络，并锁定了MiMYB107作为最可能与花青素积累正相关的候选基因。然而，研究也指出，当前工作仅基于三个品种，未来需在更广泛的种质资源、发育阶段和环境条件下进行验证，并且需要通过体外DNA结合、瞬时或稳定转化等实验对候选基因（如MiMYB107）进行功能确证。
结论：本研究对芒果R2R3-MYB基因家族进行了全基因组分析，鉴定出194个MiR2R3-MYB基因，并将其分为39个亚家族。基因结构分析显示其特征高度保守。重复分析表明，串联和片段重复是该家族扩张的主要原因。比较共线性分析发现，芒果与桃之间的R2R3-MYB基因共线性保守性更高。此外，在花青素结构基因的启动子中发现了143个潜在的MYB结合位点。对红、黄、绿芒果果皮的整合转录组和代谢组分析，鉴定出45个差异表达基因与36种花青素差异积累代谢物显著相关。8个位于调控网络中心和高连接度的候选基因被选出进行RT-qPCR验证。MiMYB107与花青素代谢物的正相关数量最多。MiMYB107-eGFP融合蛋白成功表达，并实验证实其定位于细胞核，其表达也经Western印迹进一步确认。这些发现为阐明MiR2R3-MYB基因参与芒果花青素生物合成调控网络提供了重要见解。
