大豆不同发育期酵母双杂交cDNA文库构建及SW16.1互作蛋白筛选：PolyQ等位变异定量调控互作强度并鉴定正向影响粒重的PLCP家族基因Glyma.08G116300

《Plants》：Construction of a Yeast Two-Hybrid cDNA Library from Soybean Seeds at Different Developmental Stages and Screening of SW16.1 Interacting Proteins

　　

种子重量是大豆（Glycine max）中与产量相关的关键数量性状，受多基因调控网络支配。尽管若干种子重量相关基因已被功能鉴定，但主要粒重决定基因SW16.1的互作组仍基本未被解析。本研究利用覆盖五个关键种子发育阶段的大豆品种南农1138-2发育种子混合总RNA，构建了酵母双杂交（Y2H）cDNA文库。以GmSW16.1（栽培大豆南农1138-2等位基因）为诱饵进行Y2H筛选。经多轮筛选、Sanger测序及基于功能注释的过滤，获得归属于九个不同功能类别的11个候选互作蛋白。通过点对点Y2H试验、定量α-半乳糖苷酶（α-Gal）活性测定及双分子荧光互补（BiFC）进一步验证互作。研究确认金属硫蛋白样蛋白4A相关蛋白Glyma.18G157800（GmMT4）与木瓜蛋白酶样半胱氨酸蛋白酶Glyma.08G116300均与GmSW16.1和GsSW16.1（野生大豆N24852）发生物理互作。这两个等位蛋白PolyQ（多聚谷氨酰胺）重复区内的双谷氨酰胺多态性并未消除蛋白—蛋白互作，但显著改变其对上述伙伴的互作强度。Glyma.08G116300在大豆种子发育过程中呈现优先转录积累，其转录丰度在染色体片段代换系CSSL3068与其栽培亲本南农1138-2之间随发育阶段呈动态差异。该基因在拟南芥（Arabidopsis thaliana）中异源过表达显著提高千粒重（12–15%），并增加种子长和宽。本研究提供了面向大豆种子发育研究的Y2H文库资源，并提出一个可检验的工作假说，描述整合转录调控与直接蛋白—蛋白互作的GmSW16.1-GmMT4调控节点双层调控模块。上述发现深化了对天然PolyQ等位变异如何塑造大豆粒重表现机制的理解，并为大豆分子设计育种提供候选基因材料。

研究背景方面，大豆是全球主要的油料与蛋白生产作物，其种子提供全球一半以上油料产量及超过四分之一的膳食与饲料蛋白资源。种子重量是决定大豆产量与市场品质的核心农艺性状，在驯化过程中受强烈人工选择，栽培大豆粒重由野生大豆约2 g提升至现代品种16–20 g。然而粒重是受多基因控制且易受环境波动影响的复杂数量性状，尽管已定位众多相关数量性状位点（QTL），但克隆并实验验证的基因仅占少数，这一瓶颈制约了粒重性状的机制解析与精准遗传改良。目前已通过图位克隆与全基因组关联分析分离出多个调控种子大小与粒重的基因，包括糖转运蛋白基因GmSWEET10a/b、去泛素化酶基因GmSW17、NF-YA转录因子SW14、蛋白磷酸酶基因PP2C-1、bZIP转录因子GmSW19与GmSW5、GmSK21，以及GmCYP78A72、ST1、GmST05、SoyWRKY15a等。这些研究显示大豆粒重调控依赖整合转录重编程、植物激素信号、糖代谢与蛋白稳态的多层网络，仅研究单一遗传通路难以全面揭示种子大小的调控图景，因而亟需从蛋白—蛋白互作组学视角补充认识。主要效应粒重基因SW16.1经图位克隆鉴定，编码含LIM结构域蛋白，天然种质中至少存在12个等位变异；改变PolyQ区内谷氨酰胺重复数的多态性可显著改变发育种子中金属硫蛋白编码基因GmMT4的转录丰度，栽培大豆等位GmSW16.1与野生大豆等位GsSW16.1均能结合GmMT4启动子中的ABA响应元件（ABRE）并激活其转录，有害SW16.1单倍型在驯化中的丢失是栽培大豆粒重增大的关键遗传驱动因素。植物LIM结构域蛋白参与多种发育程序，低复杂度PolyQ重复的长度变化可重塑蛋白螺旋构象从而改变转录活性与蛋白结合能力，富含PolyQ的低复杂度结构域还可能赋予类朊病毒生化特性并改变细胞蛋白功能状态。由此提出假说：SW16.1等位变异可能不仅通过调节下游基因转录，还通过重塑蛋白—蛋白互作谱发挥作用。迄今SW16.1功能研究主要集中于其作为转录调控因子的作用，其蛋白水平互作组基本未被刻画。酵母双杂交筛选是鉴定蛋白—蛋白互作的成熟大规模实验平台，已构建若干大豆组织特异性Y2H cDNA文库，包括来源于发育种子的文库，但尚无专门面向种子发育、可用于筛选GmSW16.1等粒重相关基因互作蛋白的Y2H文库。大豆种子发育伴随深刻的时空转录组重编程，将连续发育阶段等量RNA混合可最大化回收动态表达转录本，降低单时间点取样遗漏阶段特异性转录本的风险。基于上述背景，本研究旨在解析GmSW16.1的蛋白互作网络并检验PolyQ等位变异是否在种子发育过程中调节蛋白结合特性。研究目标为：产生可复用的种子发育互作组资源；鉴定GmSW16.1的真实蛋白互作蛋白；检验GmSW16.1-GmMT4节点整合转录与蛋白互作控制的双层调控模块工作假说；发掘支撑大豆粒重改良育种的候选基因资源。

研究人员开展了如下研究：利用南农1138-2五个连续发育阶段（14、21、28、35、42 DAF）种子总RNA等量混合构建Y2H cDNA文库，经诱饵自激活与毒性评估后以BD-GmSW16.1为诱饵进行文库筛选，对候选互作蛋白进行过滤、测序与多体系互作验证，并对高优先级候选Glyma.08G116300开展生物信息学表征、表达谱分析与拟南芥异源功能试验。主要结论为：成功构建高质量种子发育Y2H cDNA文库，获得11个候选互作蛋白；GmMT4与Glyma.08G116300与GmSW16.1及GsSW16.1均存在物理互作，PolyQ双谷氨酰胺等位差异不消除互作但显著改变互作强度；Glyma.08G116300在大豆种子发育中优先表达且在CSSL3068与南农1138-2间呈阶段依赖性差异；该基因在拟南芥过表达使千粒重提高12–15%并增大种子长宽。其意义在于提供可复用的种子发育互作组资源，提出GmSW16.1-GmMT4双层调控模块的可检验假说，深化对天然PolyQ等位变异塑造粒重表现机制的理解，并为大豆分子设计育种提供候选基因材料。

关键技术方法方面，研究采用基于SMART技术的长距离PCR（LD-PCR）构建多发育阶段混合RNA的酵母双杂交cDNA文库；利用GAL4系统酵母 mating 法进行文库筛选并结合点对点Y2H验证；采用定量α-半乳糖苷酶（α-Gal）活性测定比较等位间互作强度；在烟草（Nicotiana benthamiana）叶片表皮细胞中开展双分子荧光互补（BiFC）活体验证；通过qRT-PCR分析基因表达谱；并利用拟南芥（Arabidopsis thaliana）Col-0蘸花法转化获得过表达株系进行千粒重等表型鉴定。样本来源为南京农业大学大豆研究所提供的栽培大豆品种南农1138-2、野生大豆N24852及以Nannong 1138-2为背景、导入野生大豆N24852片段的染色体片段代换系CSSL3068。

研究结果方面，第一，种子发育Y2H cDNA文库的构建与质量评价：五个发育阶段总RNA琼脂糖凝胶电泳呈现28S、18S、5S三条清晰rRNA条带且无可见降解产物，浓度289.14–414.52 ng/μL，A260/A280与A260/A230均高于2.0，等质量混合后总投入1.2 μg；LD-PCR扩增ds-cDNA呈约300–6000 bp弥散分布，与线性化pGADT7-Rec共转化Y187后文库滴度为2 × 10⁷ cfu/mL，超过1 × 10⁷ cfu/mL的高质量文库标准，表明文库容量与插入片段多样性足以支撑下游互作筛选。第二，BD-GmSW16.1与BD-GsSW16.1诱饵的自激活与毒性评估：两种诱饵在SDO与SDO/X平板上均产生大量白色菌落，在含金担子素A的SDO/X/A平板上无菌落，而阳性对照组合在DDO/X/A上产生蓝色菌落；在SD/?Trp平板上诱饵菌株与空pGBKT7菌株菌落大小和增殖速率相当，表明两种诱饵均无自激活能力且对酵母无毒性，满足大规模文库筛选的质量要求。第三，Y2H文库筛选与候选互作基因鉴定：以BD-GmSW16.1为诱饵的酵母 mating 效率为2.4%，低严谨度DDO/X/A平板初筛获得约200个蓝色菌落，高严谨度QDO/X/A平板二次筛选存活110个阳性克隆，二次筛留存率约55%；对110个克隆进行菌落PCR，剔除插入片段大小相同者后选取70个非冗余克隆测序，经大豆参考基因组BLAST注释剔除18个无有效匹配克隆与14个开放阅读框错误的克隆，38个读框正确的克隆去除27个冗余序列后获得11个独特候选互作基因，功能注释将其归入九个功能类别：醇脱氢酶相关蛋白、Bowman–Birk丝氨酸蛋白酶抑制剂家族成员、S-腺苷甲硫氨酸合酶、泛醇—细胞色素c还原酶亚基、核苷二磷酸酶/焦磷酸酶、含SF2-CUPIN结构域蛋白、木瓜蛋白酶样半胱氨酸蛋白酶、植物PEC型金属硫蛋白及一个功能未知基因；依据基因功能注释及对应拟南芥同源基因在种子发育或代谢过程中的已知生物学作用，筛选出Glyma.14G156400、Glyma.16G062100、Glyma.05G222200、Glyma.08G116300与Glyma.18G157800五个高优先级候选进入点对点互作验证。第四，GmSW16.1/GsSW16.1与候选伙伴物理互作验证：五个候选与BD-GmSW16.1或BD-GsSW16.1共表达时在DDO/X/A与QDO/X/A平板上均出现蓝色菌落，空BD阴性对照无蓝色菌落，表明PolyQ双谷氨酰胺等位差异在异源酵母系统中不消除物理互作；定量α-Gal活性测定显示，仅Glyma.18G157800（GmMT4）与Glyma.08G116300在两种等位诱饵共转化间存在显著活性差异，GmMT4与BD-GmSW16.1共表达的α-Gal活性显著高于与BD-GsSW16.1共表达，Glyma.08G116300差异更为明显，其余三个候选无统计学显著变化；BiFC显示nYFP-GmMT4与nYFP-Glyma.08G116300分别与cYFP-GmSW16.1或cYFP-GsSW16.1共表达时，在细胞核内检测到明显黄色荧光蛋白信号并与DAPI核染色信号共定位，所有阴性对照组合均无YFP荧光，独立证实二者在活体植物细胞中与GmSW16.1/GsSW16.1发生物理互作。第五，Glyma.08G116300分子表征与异源功能试验：该基因编码PLCP超家族木瓜蛋白酶样半胱氨酸蛋白酶，含组织蛋白酶前肽抑制剂结构域，预测蛋白379个氨基酸残基，不稳定指数41.68提示为不稳定蛋白，脂肪族指数74.12，GRAVY为?0.524提示整体亲水，SWISS-MODEL同源建模GMQE为0.84、与模板序列一致性80.47%；系统发育分析显示该基因家族进化分歧大体与植物单双子叶分化一致，豆科物种内直系同源基因高度保守；Phytozome公共表达数据显示其转录本主要在种子发育早中期（Seed-s1至Seed-s5）积累，Seed-s5阶段达峰，营养组织与花器官中丰度很低；qRT-PCR显示其在CSSL3068与南农1138-2间21 DAF无显著差异，28 DAF在CSSL3068中显著高于南农1138-2，而35与42 DAF在南农1138-2中显著更高，提示其可能参与大豆种子发育；在拟南芥中过表达该基因，三个独立纯合T₄过表达株系（OE-1、OE-7、OE-11）千粒重较野生型提高12–15%，种子长和宽显著增大，表明其在异源背景中正向影响种子发育。

讨论部分总结如下：其一，种子发育特异性Y2H文库可作为大豆粒重研究的可复用互作组资源，该文库滴度2 × 10⁷ cfu/mL、插入片段约300–6000 bp，满足大规模筛选标准，与以往多来自营养组织或胁迫处理材料的文库相比专为种子个体发育构建，多阶段RNA混合策略在代表性与实验可操作性间取得平衡，可提高回收不同发育阶段活跃转录本的可能性，但混合可能稀释局限于狭窄发育窗口的低丰度转录本，未来可辅以阶段特异性或单细胞文库，该资源不仅可用于GmSW16.1，也可用于其他粒重相关蛋白筛选。其二，GmSW16.1互作组提示大豆粒重控制中的多通路协同，11个候选分属九个功能类别，功能多样性与种子大小和重量受相互关联调控网络而非线性遗传通路支配的观点一致，GmMT4与Glyma.08G116300的获得提示GmSW16.1与蛋白水解调控、金属离子稳态及细胞氧化还原平衡间可能存在联系，GmSW16.1的LIM结构域可能提供支架样界面以结合功能各异的伙伴；但Y2H在异源酵母环境进行且易产生假阳性，仅经多种正交试验支持的候选才应视为高置信互作蛋白，本研究中GmMT4与Glyma.08G116300经点对点Y2H、X-α-Gal与BiFC验证，其余九个候选尚待验证，且部分依赖拟南芥同源基因已知功能的分级策略可能排除无明确参考同源基因的大豆特异或新互作蛋白，未来应结合无偏互作筛选与基于结构域、进化及组织特异性的分级。其三，提出整合转录与蛋白水平控制的双层GmSW16.1–GmMT4调控模块：既往工作表明GmSW16.1作为转录激活因子直接结合GmMT4启动子ABRE元件促进其转录，GmMT4转录丰度与粒重正相关，本研究进一步显示GmSW16.1及其野生等位GsSW16.1与GmMT4蛋白物理互作，支持GmSW16.1在GmMT4基因转录激活与GmMT4蛋白产物直接互作两个相互关联层面调控其功能的双层调控模块工作假说，该假说超越将SW16.1主要视为转录因子的主流观点；金属硫蛋白参与金属解毒、金属离子稳态与活性氧管理，若SW16.1在发育种子中与GmMT4物理结合，可能影响GmMT4蛋白稳定性、金属结合能力、亚细胞定位或对转录输出的反馈，从而为SW16.1等位变异与粒重数量变化间提供可能联系，但这仍为工作假说而非已证实的调控机制，尚需发育大豆种子共免疫沉淀、大豆原生质体分裂荧光素酶或FRET试验及GmMT4稳定性与金属结合活性的生化检测等活体证据。其四，PolyQ长度变异定量调节而非消除蛋白—蛋白互作：本研究的核心发现是GmSW16.1与GsSW16.1 PolyQ重复区内双谷氨酰胺多态性未消除与GmMT4或Glyma.08G116300的互作，但显著改变对这两个伙伴的互作强度，这一互作发生与互作强度的区分提示低复杂度区天然等位变异可作为蛋白互作网络的定量修饰因子而非重连整个互作组的简单开关，其余候选未显示统计学显著的等位依赖互作强度差异，说明PolyQ长度变异效应具有伙伴特异性而非全局性；需注意α-半乳糖苷酶报告活性反映特定酵母试验条件下互作相关报告信号，仅作为等位间互作强度的比较性代理指标，不等同于直接测定的生化结合亲和力；基于PolyQ重复可形成由谷氨酰胺侧链与主链间非常规氢键稳定的螺旋构象且螺旋倾向随重复长度增加的结构研究，推测两个谷氨酰胺残基的增减不足以破坏SW16.1整体折叠或全局互作选择性，但可能重塑PolyQ区周围局部构象，改变特定结合界面可及性并选择性调节对GmMT4与Glyma.08G116300等伙伴的亲和力，该模型补充了SW16.1等位变异影响GmMT4转录的既往遗传证据，为小编码序列多态性如何在驯化中产生定量表型分化提供可能机制解释，但该构象解释源自已发表结构研究，需用重组GmSW16.1与GsSW16.1蛋白直接实验验证。其五，Glyma.08G116300作为正向影响粒重的PLCP家族候选：木瓜蛋白酶样半胱氨酸蛋白酶在植物中构成大蛋白酶超家族，参与种子萌发中储藏蛋白动员、程序性细胞死亡、器官衰老、免疫应答与发育重编程等过程，多数已鉴定PLCP功能与萌发、衰老或胁迫响应相关，本研究将其鉴定为在种子发育早中期优先积累、Seed-s5达峰的种子发育相关PLCP，异源过表达使拟南芥千粒重提高12–15%并增大种子长宽，提示该蛋白酶具有在异源植物背景中正向影响种子大小的能力，拓展了PLCP潜在功能范围；其在CSSL3068与南农1138-2间28 DAF与35、42 DAF方向相反的表达差异为联系该基因与种子发育进程提供额外证据，CSSL3068作为携带野生大豆N24852导入片段的近等基因平台可在最小背景噪声下比较等位依赖表达动态，但该表达差异的阶段依赖方向需谨慎解读，其在大豆粒重控制中的内源功能仍需功能缺失与稳定转基因验证；当前表型证据仅来自拟南芥异源过表达，缺乏功能缺失敲除与大豆稳定过表达数据，故不能断言其为大豆粒重内源正调控因子，未来应以CRISPR/Cas9敲除与大豆稳定过表达（最好在多个遗传背景中）确定其操作是否影响种子大小、粒重及其他产量相关性状，并应表征其蛋白酶活性、鉴定内源底物、确定其与GmSW16.1物理互作是否调控其稳定性、活性或底物特异性。

结论部分译文：综上，研究人员成功构建了代表大豆多个连续种子发育阶段的高质量Y2H cDNA文库，以GmSW16.1为诱饵鉴定出11个候选互作蛋白；通过多种正交互作验证试验，确认栽培大豆来源的GmSW16.1与野生大豆来源的GsSW16.1均与GmMT4（Glyma.18G157800）及PLCP家族半胱氨酸蛋白酶Glyma.08G116300发生物理互作，PolyQ重复区内的双谷氨酰胺等位多态性不消除这些蛋白—蛋白互作，但显著调节其结合强度；结合本研究蛋白互作数据与既往转录调控证据，提出一个可检验的工作假说，即整合转录控制与直接蛋白—蛋白互作、支配GmSW16.1-GmMT4调控节点的双层调控模块；Glyma.08G116300在大豆种子发育过程中呈优先表达，其在拟南芥中异源过表达显著提高种子重量，但其在大豆中的内源生理功能仍待利用大豆转基因材料验证；本研究为驯化相关等位变异驱动的粒重分化提供新的机制认识，并为大豆分子设计育种提供候选基因资源，其多阶段种子文库构建流程亦为面向作物种子系统的组织特异性互作组研究提供实用方法学参考。