《Toxins》：Down-Regulation of eIF3L Is Associated with Decreased Susceptibility of Helicoverpa armigera to Cry1Ac
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大规模种植转Bt（Bacillus thuringiensis）作物已导致靶标害虫对Bt蛋白尤其是Cry1Ac产生抗性。在持续选择压力下，棉铃虫（Helicoverpa armigera）在实验室和田间种群中均已进化出对Bt蛋白的抗性，这凸显了全面阐明害虫Bt
大规模种植转Bt（Bacillus thuringiensis）作物已导致靶标害虫对Bt蛋白尤其是Cry1Ac产生抗性。在持续选择压力下，棉铃虫（Helicoverpa armigera）在实验室和田间种群中均已进化出对Bt蛋白的抗性，这凸显了全面阐明害虫Bt抗性分子机制的迫切需求。既往研究已证实真核翻译起始因子eIF2在调控Bt抗性中发挥关键作用。研究人员前期RNA-seq数据显示，eIF3L在棉铃虫敏感品系与Cry1Ac抗性品系之间的表达水平存在显著差异。本研究中，研究人员进一步观察到，在Cry1Ac暴露后存活的幼虫中eIF3L的mRNA水平显著降低。更重要的是，eIF3L的异源表达提高了Sf9细胞对Cry1Ac的敏感性。与此一致，敲低eIF3L与棉铃虫幼虫暴露于Cry1Ac时死亡率降低相关。综合体内与体外结果，研究人员认为eIF3L参与Cry1Ac的毒性作用。此外，eIF3L影响Cry1Ac受体基因CAD、ABCC2和ABCC3的表达。总体而言，这些结果表明eIF3L下调与棉铃虫对Cry1Ac敏感性降低相关，为昆虫对Bt蛋白抗性的分子机制提供了新的见解。
研究背景：转Bt（Bacillus thuringiensis）作物的广泛种植带来了显著的经济与环境效益，但随着其大面积应用，靶标害虫对Bt蛋白的抗性逐渐加剧，已涉及至少11种害虫和9种杀虫蛋白，严重威胁Bt蛋白的长期有效性。Cry晶体蛋白（Crystalline toxin）被昆虫取食后经蛋白酶活化，与中肠特异性受体结合，损伤上皮细胞并最终导致昆虫死亡；毒素活化与毒素结合相关基因的突变或表达变化均可导致抗性，其中中肠受体突变或下调被认为是抗性产生的主要原因。已鉴定的中肠受体主要包括碱性磷酸酶（ALP）、钙黏蛋白（CAD）、氨肽酶（APN）和ATP结合盒（ABC）转运蛋白。近年研究还发现转录因子FOXA与GATA参与调控Cry1Ac受体基因表达，MAPK信号通路亦通过转录因子调控Cry中肠受体基因表达，转录与翻译调控在调节受体表达中的重要性日益受到重视。真核翻译起始因子（eIF）是蛋白质合成起始阶段的主要调控因子，并具有翻译起始之外的调控功能。已有研究表明，棉铃虫Cry1Ac抗性品系中eIF2转录水平显著降低，且eIF2调控受体基因CAD、ABCC2和ABCC3的表达从而赋予抗性。eIF3由13个保守亚基（a~m）组成，在起始过程中发挥核心作用，其亚基对生物在多种胁迫条件下的生存至关重要；在秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）中，eIF3k或eIF3l突变可增强一般胁迫抗性。既往酵母双杂交筛选已将eIF3L鉴定为Cry1Ac的潜在互作蛋白，但eIF3L是否参与Cry1Ac毒性仍不清楚。研究人员前期RNA-seq数据发现eIF3L在棉铃虫敏感与抗性品系间差异表达，因此开展本研究以探究eIF3L在Cry1Ac毒性与抗性中的作用。
研究内容与结论：研究人员通过qRT-PCR、细胞毒性实验和RNA干扰（RNAi），系统研究了eIF3L在Cry1Ac毒性及抗性中的作用。结果显示，eIF3L下调与棉铃虫对Cry1Ac敏感性降低相关，且eIF3L影响Cry1Ac受体基因CAD、ABCC2和ABCC3的表达。该研究首次报道eIF3L与Cry1Ac受体基因表达之间的关联，为深入探究其分子机制提供了理论基础，并为害虫抗性治理策略的制定提供了新思路。
关键技术方法：研究使用棉铃虫敏感品系96S（1996年采自中国河南新乡田间）及经实验室选育、对Cry1Ac抗性倍数约3000倍的抗性品系BtR；采用qRT-PCR检测基因转录水平，以RPS15为内参基因、2?ΔΔCt法计算相对表达量；构建pIEx-eIF3L-GFP进行Sf9细胞瞬时表达并结合台盼蓝染色开展细胞毒性实验，以Western blot验证蛋白表达；通过显微注射dsRNA进行RNAi并结合人工饲料生测；采用双荧光素酶报告基因实验检测受体基因启动子活性。
研究结果：
2.1 eIF3L的生物信息学特征与系统发育分析：从棉铃虫克隆获得eIF3L全长开放阅读框（ORF），长1632 bp，编码543个氨基酸残基，预测分子量63.43 kDa、pI 6.11；基于NCBI数据库61条不同昆虫序列以邻接法（NJ）构建系统发育树，显示eIF3L蛋白与斜纹夜蛾（T. ni）同源性最高且进化保守。
2.2 eIF3L在棉铃虫中的时空表达：qRT-PCR显示eIF3L在各生命阶段均有表达，蛹期转录水平最高，其次为卵、幼虫和成虫，四龄幼虫最低；五龄幼虫各组织中马氏管转录丰度最高，其次为前肠、后肠、中肠、血淋巴、头部、表皮和脂肪体。
2.3 Cry1Ac处理幼虫及抗性品系中eIF3L表达降低：敏感品系96S幼虫取食含Cry1Ac（100 μg/g）人工饲料后，中肠eIF3L相对表达量较对照组显著下降；与96S品系相比，BtR品系中eIF3L表达显著下调。
2.4 eIF3L瞬时表达增强Sf9细胞对Cry1Ac的敏感性：转染后GFP荧光及Western blot证实eIF3L成功过表达；转染48 h后加入活化Cry1Ac，表达eIF3L-GFP的细胞死亡率较仅表达GFP的细胞显著升高约41个百分点。
2.5 敲低eIF3L与Cry1Ac处理下幼虫死亡率降低相关：注射dsRNA 48 h后eIF3L沉默效率约49%；在300 μg/g Cry1Ac处理下，幼虫死亡率较对照显著降低约17个百分点。
2.6 eIF3L影响受体基因CAD、ABCC2和ABCC3的表达：敲低eIF3L显著降低CAD、ABCC2和ABCC3的mRNA丰度；双荧光素酶报告实验显示共转染eIF3L显著提高受体基因启动子驱动的荧光素酶活性。
讨论与结论：研究人员指出eIF3L在棉铃虫各阶段和组织中广泛表达，与鳞翅目昆虫其他eIF基因表达模式一致；其在马氏管和肠道中表达较高，提示可能参与胁迫响应。Cry1Ac处理后存活幼虫中eIF3L转录水平降低，但作者也指出因样本仅来自存活个体，尚不能确定该下降由Cry1Ac抑制所致还是低表达个体的选择性存活所致，后续应监测各时间点幼虫生长并收集全部个体肠道组织。Sf9细胞中eIF3L瞬时表达增强Cry1Ac敏感性、RNAi敲低降低幼虫死亡率，与既往研究一致；但eIF3L作为翻译起始因子，其敲低可能改变幼虫一般生理状态，需设置无毒素对照并测定取食与生理参数以排除非特异性效应。受体基因方面，结果仅限于转录水平和启动子活性分析，机制尚不明确，应视为eIF3L可能影响受体基因表达的初步证据而非直接转录调控的确证，未来需在昆虫细胞系中区分转录与翻译效应。研究首次报道eIF3L与Cry1Ac受体基因表达的关联。eIF3L具有动态亚细胞分布并可响应特定刺激发生重定位，除翻译起始外可能具有其他生理功能；结合人类疾病研究中雄激素诱导的棕榈酰化驱动eIF3L膜定位及棉铃虫中eIF3L可能与Cry1Ac互作的报道，研究人员推测eIF3L可能直接或间接与Cry1Ac互作：其一，eIF3L调控受体基因表达从而影响Cry1Ac结合能力与毒性；其二，eIF3L可能通过与Cry1Ac互作或调节细胞胁迫响应而不依赖受体表达影响毒性，未来需进一步研究以区分这两种假说。本研究未测定受体蛋白水平及Cry1Ac结合能力，尚不能将受体mRNA变化与敏感性变化直接关联，未来应以Western blot检测受体蛋白并进行Cry1Ac结合实验。此外，MAPK信号通路在eIF功能调控中起重要作用，eIF亦与昆虫繁殖和变态发育密切相关，eIF是否与免疫或激素通路互作进而影响昆虫对Cry1Ac的抗性值得进一步研究。研究结论为：敲低eIF3L与棉铃虫幼虫对Cry1Ac敏感性降低相关，这些发现为棉铃虫对Cry1Ac的抗性机制提供了新见解，并对害虫抗性治理策略的开发具有积极影响。
