三重掺杂（Mg、Zn、Sr）β-磷酸三钙陶瓷的生物仿生合成、飞秒激光诱导微结构形成及生物学评价

《Biomimetics》：Triple-Doped (Mg, Zn, Sr) β-Tricalcium Phosphate Ceramics: Biomimetic Synthesis, Femtosecond Laser-Induced Microstructure Formation and Biological Assessment

　　

三重掺杂取代与飞秒激光表面微结构化是协同调控β-磷酸三钙（β-TCP）陶瓷理化、结构和生物学性能用于骨组织工程的策略。本研究合成了掺入Mg（8–9 mol%）、Zn（3 mol%）和Sr（1 mol%或5 mol%）的β-TCP陶瓷材料，其（Ca + Mg + Zn + Sr）/P摩尔比为1.51或1.55。合成采用在模拟体液（SBF）中于pH 8.0–8.2条件下进行仿生沉淀，随后压片并在高达1000 °C下煅烧。通过应用平行线以及90°和45°交线扫描图案，研究了飞秒激光织构化的效果。利用扫描电子显微镜（SEM）、光学轮廓仪和水接触角测量对材料进行了表征。结果表明，激光辐照形成了分级微通道和多孔颗粒状结构，且无热裂纹。对于含5 mol% Sr的组分，交线图案（45°角）产生了最高的表面粗糙度（Sa = 4.95 μm），而未处理对照样品的Sa值为2.45 μm。水接触角测量显示亲水性显著增加。含1 mol% Sr样品的接触角从83.05°降至34.19°，而所有含5 mol% Sr的激光处理表面均表现出液滴立即铺展，表明其为亲水润湿行为。初步生物学测试显示，在测试条件下，HaCaT细胞活力未见显著降低，细胞形态亦无明显不良变化。大肠杆菌（E. coli）的细菌粘附因表面构型而异；与其他测试变体相比，平行线织构化样品的定植程度较低。这些结果表明，对经Mg（8–9 mol%）、Zn（3 mol%）和Sr（1 mol%或5 mol%）改性的β-TCP陶瓷进行飞秒激光加工，可生成具有可测量的粗糙度、润湿性和初始生物学响应差异的特定表面结构。需采用适当的成骨细胞模型并对组成和表面结构进行系统控制开展进一步研究，以确定这些发现的生物学意义。

研究背景与科学问题

骨缺损修复是临床重大挑战，钙磷陶瓷因其优异的骨传导性和生物相容性而被广泛应用于骨组织工程。其中，β-磷酸三钙（β-TCP）因其良好的生物可吸收性受到重点关注。然而，纯β-TCP的生物学活性有限，需要通过离子取代进行成分改性。镁（Mg²⁺）在骨代谢中起重要作用并可改善细胞粘附和增殖；锌（Zn²⁺）能刺激成骨细胞活性并具有抗菌特性；锶（Sr²⁺）则能刺激成骨细胞增殖分化并抑制破骨细胞活性。将这些生物相关离子共掺杂到β-TCP结构中，有望协同增强材料的理化和生物学性能。尽管已有研究探索了单一或二元离子取代，但关于Mg、Zn、Sr三元共掺杂的信息仍然匮乏。此外，即使经过成分优化，取代钙磷陶瓷的表面特性（如形貌、粗糙度、润湿性）仍可能限制其再生潜力。因此，有必要结合先进的表面工程策略来更好地调控细胞-材料相互作用。飞秒激光加工能够在极短脉冲持续时间内实现高度局域化的能量沉积，从而精确可控地改变表面形貌而不影响材料本体成分，为功能化钙磷陶瓷提供了理想工具。基于前期对Mg、Zn取代β-TCP的研究，本研究将锶以两种不同浓度（1 mol%和5 mol%）引入体系，旨在探究Sr含量对陶瓷表面特性的影响，并评估飞秒激光织构化作为定制表面架构、粗糙度和润湿性工具的潜力，同时开展初步生物学评估以探索成分、表面特征与生物学行为之间的关联。

研究方法概述

研究人员首先采用仿生连续沉淀法，以科库博模拟体液为溶剂，在pH 8.0–8.2条件下合成非晶态（Sr、Mg、Zn）修饰的磷酸钙前驱体。合成过程中利用自动滴定系统精确控制反应条件，所得粉末经球磨、过筛后压制成片，并在最高1000 °C下进行煅烧以获得β-TCP相陶瓷片。随后，使用波长为800 nm、脉冲宽度70 fs、重复频率1 kHz的钛蓝宝石飞秒激光系统，通过振镜扫描头对烧结后的陶瓷片进行表面织构化处理。激光加工参数固定为功率50 mW、扫描速度1.0 mm/s，并采用三种不同的扫描策略：平行线、90°交叉线和45°交叉线。最后，利用电感耦合等离子体发射光谱法测定样品中的离子含量，采用粉末X射线衍射进行物相鉴定，通过场发射扫描电子显微镜观察微观形貌，使用光学轮廓仪定量表征三维表面形貌和粗糙度参数，并通过静态和动态水接触角测量评估表面润湿性。生物学评估方面，采用直接接触法检测人角质形成细胞系（HaCaT）的细胞相容性，并使用平板计数法和扫描电镜评估大肠杆菌（E. coli）K12菌株的粘附和存活情况。

研究结果

3.1 三重掺杂（Mg、Zn、Sr）-β-TCP陶瓷片的制备与表征

化学分析证实，Zn和Sr的掺入浓度与目标值相符，而Mg的实际掺入量约为引入量的一半。两种系列（Sr1和Sr5）合成的非晶态磷酸钙的（Ca + Zn + Mg + Sr）/P摩尔比分别为1.55和1.51，接近β-TCP的理论值1.5。粉末X射线衍射分析显示，煅烧后主衍射峰与白磷钙矿标准卡片吻合，证实形成了β-TCP型晶体结构。随着煅烧温度升高，衍射峰强度增大且半峰宽变窄，表明结晶度提高。与标准谱图对比，合成样品的衍射峰发生位移，表明掺杂离子的同晶取代改变了晶格参数。

3.2 飞秒激光诱导微结构形成与润湿性评估

扫描电镜观察表明，未经处理的对照组表面相对光滑且呈颗粒状。飞秒激光处理后，成功形成了清晰的微沟槽和分级微结构。平行线扫描产生单向沟槽，而交叉扫描（90°和45°）则形成了网格状架构。高倍率图像显示所有激光图案化样品表面均出现了多孔颗粒状泡沫结构，且未观察到明显的熔化、开裂或热降解现象。光学轮廓仪定量分析表明，表面粗糙度强烈依赖于激光扫描几何构型。对于Sr1系列，45°交叉线图案获得了最高的粗糙度值（面粗糙度Sa = 3.31 μm，线粗糙度Ra = 2.09 μm）。对于Sr5系列，同样以45°图案的粗糙度最高，且其Sa值达到4.95 μm，是所有研究组中最高的。值得注意的是，在相同激光处理条件下，Sr5样品始终表现出比Sr1对应样品更高的Sa值，特别是45°图案的Sa值从3.31 μm增至4.95 μm，增幅约50%，表明陶瓷成分影响了激光-材料相互作用。水接触角测量结果显示，未处理的Sr1和Sr5对照样品分别呈现83.05°和84.59°的中等亲水角。激光处理后，所有Sr1表面的接触角显著降至34.19°至40.92°范围，降幅达50–60%。更为显著的是，所有激光处理的Sr5表面在液滴滴落后立即完全铺展，无法可靠测量平衡接触角，表明其转变为超亲水状态。

3.3 对细菌活力和细胞形态的影响

平板计数结果显示，与对照组相比，激光处理样品的菌落形成单位（CFU）值更低。在所有激光处理组中，平行线图案的样品（Sr1-lines和Sr5-lines）表现出最低的CFU值，表明其对细菌生长具有最强的抑制作用。90°交叉线图案的细菌数量约为平行线组的两倍，但仍远低于45°交叉线组。扫描电镜观察进一步证实，激光处理样品表面的粘附细菌数量较对照组显著减少。Sr5陶瓷片比Sr1更有效地降低了细菌细胞的粘附能力。平行线图案样品表面细菌分布最为稀疏，其他激光处理样品也显示出不均匀分布和细胞密度降低。所有样品均未观察到细菌细胞壁变形或形态异常。

3.4 细胞相容性测试

直接接触细胞毒性实验采用HaCaT角质形成细胞系。经过24小时和48小时的共培养，与未处理对照组相比，所有激光处理陶瓷片均未引起细胞死亡率的增加。相差显微镜观察显示，各组细胞形态均未发生明显的不良变化。这表明，无论是基底陶瓷本身还是飞秒激光诱导的表面改性，在测试条件下均未对HaCaT细胞产生细胞毒性或形态学上的不利影响。

讨论总结与研究结论

研究讨论指出，仿生合成路线成功制备了保持β-TCP晶体结构的Mg、Zn、Sr三元掺杂陶瓷。飞秒激光加工产生的表面形貌强烈依赖于扫描几何构型，45°交叉线因有效重叠面积更大而获得最高粗糙度。Sr含量的增加增强了激光织构化效应，使Sr5系列在相同条件下获得更高粗糙度，这可能与Sr取代改变了陶瓷的光学吸收、电子激发或热输运等局部物理性质有关，但具体机制尚需进一步研究。表面粗糙度的增加与润湿性的显著提升密切相关，符合温泽尔模型，即粗糙表面放大了本征亲水性。激光处理Sr5表面达到完全铺展的超亲水状态。重要的是，抗菌效果并非简单地与粗糙度成正比——平行线图案虽然粗糙度不是最高，却展现出最佳的抑菌效果，这表明表面特征的空间排列（如沟槽取向、连续性）比单纯的粗糙度数值更能影响细菌附着。润湿性变化与表面形貌紧密耦合，共同构成了激光处理的综合物理化学效应。陶瓷成分（尤其是较高Sr含量）也可能通过影响表面状态和潜在的离子释放行为参与调节细菌反应。细胞相容性实验表明，激光处理未引入细胞毒性，这符合植入体表面期望的理想行为——限制细菌定植而不损害宿主细胞。但研究者强调，由于实验变量（激光图案、粗糙度、润湿性、成分）同步变化，无法独立量化各因素的贡献，未来需通过独立调控形貌和化学成分的研究加以区分。

研究结论部分翻译如下：

通过仿生沉淀结合煅烧的方法成功制备了三重掺杂（Mg、Zn、Sr）-β-TCP陶瓷片，获得了掺入Mg²⁺（8–9 mol%）、Zn²⁺（3 mol%）和Sr²⁺（1或5 mol%）离子的β-TCP型晶相。将Sr含量从1 mol%增至5 mol%并未改变主晶相，但影响了陶瓷对飞秒激光加工的响应。激光处理采用了平行线以及90°和45°交叉图案，实现了不同表面架构的制备。扫描电镜观察和光学轮廓测量显示，掺入5 mol% Sr增强了激光织构化效果。在相同的激光处理条件下，样品始终表现出比其含1 mol% Sr对应物更高的面粗糙度值，这一效应在45°图案中尤为明显。初步生物学评估提供了关于织构化陶瓷与HaCaT角质形成细胞及大肠杆菌相互作用的初步信息。在两个锶系列中，实验条件下均未检测到HaCaT细胞活力的显著降低，表明在此细胞模型中无明显细胞毒性效应。细菌定植在所研究的表面之间存在差异，含1和5 mol% Sr且具有平行线微结构的样品显示出比其他测试表面条件更低的大肠杆菌定植水平。总体而言，这些结果证明了飞秒激光织构化在多元素取代β-TCP陶瓷上生成受控表面架构并改变其粗糙度和润湿行为的潜力。然而，普遍的抗菌效果以及Sr含量、粗糙度、润湿性和扫描几何构型的各自贡献仍有待确定。后续研究应评估成骨活性、长期细胞反应和细菌粘附，同时对陶瓷成分和激光生成的表面架构进行独立评估。