《Biomimetics》：Modulation of Primary Chondrocyte Responses by Silk Fibroin Scaffold Architecture In Vitro
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关节软骨是一种高度特化的无血管组织，其内在再生能力有限，使得软骨缺损的治疗尤为困难。丝素蛋白（SF）因其生物相容性、可调降解性以及可加工为三维结构的多功能性，成为软骨组织工程中有前景的生物材料。本研究采用冷冻干燥（FD）或冷冻-解冻（FT）两种方法，由同一丝素
关节软骨是一种高度特化的无血管组织，其内在再生能力有限，使得软骨缺损的治疗尤为困难。丝素蛋白（SF）因其生物相容性、可调降解性以及可加工为三维结构的多功能性，成为软骨组织工程中有前景的生物材料。本研究采用冷冻干燥（FD）或冷冻-解冻（FT）两种方法，由同一丝素蛋白水溶液制备了两种SF支架，以阐明加工诱导的架构差异如何调控软骨细胞响应。形态学分析显示，FD支架具有更高的孔隙率和更大的孔径，而FT支架呈现更致密的结构和显著更高的压缩模量，凸显了不同的结构-性能关系。衰减全反射傅里叶变换红外光谱（ATR-FTIR）分析进一步揭示FT支架具有更高的β-折叠含量，表明丝素蛋白分子组织存在加工依赖性差异。这些结构差异转化为不同的生物学结果。FD支架支持更高的软骨细胞代谢活性，与其更开放的多孔架构一致。相反，FT支架促进了软骨相关标志物（包括COL2A1和ACAN）更强的表达，表明软骨生成成熟增强。总体而言，结果表明丝素蛋白支架架构调控细胞代谢活性与软骨特异性基质产生之间的平衡。通过加工技术精确调控支架架构的能力代表了优化丝素蛋白基软骨组织工程系统的关键策略。
关节软骨是覆盖于滑膜关节骨对立面的高度特化透明结缔组织，在载荷传递、冲击吸收以及为关节运动提供光滑低摩擦界面方面发挥基础性作用。结构上，关节软骨的特征是低细胞密度和致密高度有序的细胞外基质（ECM），主要由II型胶原和富含糖胺聚糖（GAGs）的蛋白聚糖组成，由驻留的软骨细胞合成和维持。该组织的一个决定性特征是没有血管、淋巴引流和神经支配，加之成熟软骨细胞增殖和迁移能力有限，严重限制了其内在再生潜能。因此，由创伤、运动损伤或退行性疾病引起的关节软骨缺损无法自发愈合，并常进展为骨关节炎（OA），后者是全球疼痛和残疾的主要原因。损伤后，软骨退变通常始于浅表区蛋白聚糖丢失和胶原纤维网络破坏，随后延伸至中层和深层，最终导致软骨细胞退变和细胞丢失。目前的临床策略包括微骨折、自体移植和异体移植，主要旨在缓解症状而非恢复原生软骨结构和功能。尽管微骨折仍是金标准手术技术，但常导致纤维软骨形成，其力学性能劣于透明软骨且缺乏长期耐久性。同样，骨软骨移植技术受限于供区并发症、组织可用性以及与周围原生软骨整合不良。组织工程已成为软骨修复的有前景的替代方法，整合细胞、生物材料和生物活性信号以重建有利于软骨再生的微环境。在此框架内，三维支架通过提供机械支持和空间引导促进细胞黏附、增殖和分化，同时促进新合成ECM的沉积，发挥关键作用。特别是基于水凝胶的支架非常适合软骨组织工程，因为它们密切模拟原生软骨的高度水合和黏弹性特征，能够有效扩散营养物质和代谢废物，并支持软骨细胞活力和功能。胶原、透明质酸和硫酸软骨素等天然生物材料因其优异的生物相容性和重现原生软骨ECM关键生化线索的能力而得到广泛研究。这些材料促进软骨细胞表型的维持并增强软骨特异性ECM成分的合成，包括II型胶原和聚集蛋白聚糖。此外，生物活性分子特别是转化生长因子-β（TGF-β）家族成员的掺入已被证明可引导软骨生成分化并进一步刺激基质产生，从而提高再生组织的质量。近期进展促进了智能和刺激响应性支架的发展，包括3D打印和软骨仿生构建体，它们能够对关节微环境内的机械或生化线索作出动态响应。这些下一代支架在提供增强的机械稳定性的同时能够精确调控细胞行为，为实现功能相关的软骨再生提供了新机遇。尽管临床前结果令人鼓舞，但临床转化仍面临重大挑战，包括再生组织的长期稳定性、与原生软骨和软骨下骨的整合以及监管方面的考虑。丝素蛋白（SF）是一种主要来源于家蚕茧的天然蛋白质聚合物，因其机械、生化和加工性能的有利组合而成为软骨组织工程中极具前景的支架材料。SF具有优异的生物相容性、极低的免疫原性和可调的降解特征，使其理化特性能够被定制以满足软骨再生的需求。SF中富含β-折叠的结晶域赋予机械稳定性，而无定形区域则提供柔韧性并促进细胞-材料相互作用，支持软骨细胞黏附、活力和长期培养。重要的是，SF支架可被制备成多种架构，包括多孔海绵、静电纺丝纤维网、水凝胶和三维构建体，从而能够重建有利于软骨细胞表型维持和细胞外基质沉积的微环境。在基于SF的三维系统中，软骨细胞已被证明能够保持圆形形态并维持软骨特异性标志物如II型胶原和聚集蛋白聚糖的表达，同时最大限度地减少二维培养中常见的去分化。此外，SF支架支持新合成细胞外基质的积累和组织，有助于改善工程化组织的机械完整性。SF的水基加工进一步允许掺入生物活性分子，包括生长因子和糖胺聚糖，在不损害支架完整性的情况下增强软骨生成信号和基质产生。总体而言，基于仿生支架的策略是支持软骨细胞生长、保持其分化表型以及促进结构和功能适当的细胞外基质沉积的关键途径。持续优化支架组成、架构和生物功能化对于克服当前局限性和提高软骨组织工程方法的临床有效性至关重要。
研究人员在本研究中考察了两种丝素蛋白基支架系统作为软骨组织工程的临时三维基质。研究人员开展了以下研究：通过冷冻干燥（FD）和冷冻-解冻（FT）两种加工方法从同一5%（w/v）丝素蛋白水溶液制备支架，系统比较了两种支架的形态学特征（孔隙率、孔径、孔密度）、二级结构（ATR-FTIR分析β-折叠含量）、水解稳定性与蛋白释放行为、压缩力学性能，以及对人原代软骨细胞代谢活性（MTT法）和软骨生成标志物表达（实时定量PCR和Western blot）的影响。结论表明，支架制造方法是丝素蛋白支架工程中的关键设计变量，直接决定支架分子组织、架构、水合行为、力学性能以及最终的软骨细胞响应。FD支架有利于高度多孔和顺应性微环境，与增加的细胞代谢活性相关；而FT支架产生更致密和更坚硬的结构，更有效地支持软骨特异性标志物和基质相关蛋白的表达。这些发现确定了加工驱动的架构调控作为指导细胞代谢活性与软骨生成成熟之间平衡的有效策略，并支持丝素蛋白作为软骨再生定制支架系统开发的多功能平台。
研究人员为开展本研究采用的主要关键技术方法包括：支架制备采用冷冻干燥法（FD，由Caresilk S.r.l.s.提供预制品）和冷冻-解冻法（FT，将5%丝素蛋白溶液与1% DMSO混合后在?20 °C冷冻14 h后室温解冻），人原代软骨细胞购自Celprogen（Torrance, CA, USA），使用第2代至第10代以内的细胞进行实验；形态学表征采用冰冻切片（20 μm）结合光学显微镜和ImageJ图像分析；二级结构分析采用ATR-FTIR光谱（JASCO FT/IR-6300）结合酰胺I带高斯曲线拟合；水解稳定性通过PBS中37 °C孵育28天评估溶胀率和质量损失，蛋白释放采用BCA蛋白定量试剂盒测定；力学性能采用万能试验机（ZwickRoell）进行无约束压缩测试（2–10%应变区间计算压缩模量）；细胞代谢活性采用MTT法；基因表达采用实时定量PCR（CFX Connect系统，SYBR Green检测，Rplp0为内参基因，ΔΔCt法计算）；蛋白表达采用Western blot（以β-actin为内参）。
3.1 形态学表征：通过光学显微镜观察和ImageJ定量形态学分析，发现FD支架总孔隙率显著更高（74.4 ± 1.9% vs. 56.6 ± 4.6%），孔径显著更大（140.8 ± 7.9 μm vs. 81.4 ± 6.1 μm），而FT支架孔密度更高（50.2 ± 8.1 pores/mm
2 vs. 26.5 ± 1.9 pores/mm
2），表明冷冻干燥产生高度多孔的大孔结构，而冷冻-解冻促进更致密、孔隙更小更多的形态。
3.2 FTIR分析：通过ATR-FTIR光谱对酰胺I带（1595–1705 cm
?1）进行高斯曲线拟合定量分析，发现FT支架β-折叠含量显著高于FD支架（41.9 ± 0.3% vs. 36.2 ± 0.8%），表明两种加工路线导致丝素蛋白二级结构存在差异，冷冻-解冻过程中的凝胶化可能促进分子重排和β-折叠形成。
3.3 水解稳定性与蛋白释放：通过37 °C PBS孵育28天的溶胀率和质量损失测定以及BCA蛋白定量，发现FD支架在所有时间点均显示更高的溶胀率，且在孵育1 h内质量损失即达约22%后趋于稳定，而FT支架质量损失全程低于7%；FD支架的累积蛋白释放量在所有时间点均显著高于FT支架（p < 0.001），与其更高的孔隙率和表面可及性一致。
3.4 力学性能：通过水合状态下的无约束压缩测试，发现两种支架均呈现多孔聚合物支架典型的非线性力学行为，FT支架压缩模量显著高于FD支架（6.85 ± 0.38 kPa vs. 3.07 ± 0.17 kPa，p < 0.001），在10%和约20%应变下FT支架的压缩应力也均高于FD支架，表明FT支架在压缩载荷下具有更稳健的结构。
3.5 细胞代谢活性：通过MTT法在3、7、14天评估细胞代谢活性，发现所有条件下均呈时间依赖性增加；培养3天时FD和FT支架上的细胞代谢活性分别比2D系统高70.8%和16.8%；至14天时FD和FT支架相对第3天分别增加约664.8%和413.5%；FD支架支持的细胞代谢活性高于FT支架，与其更开放的多孔架构一致。
3.6 丝素蛋白支架增强软骨细胞特异性标志物表达：通过实时定量PCR评估SOX9、COL2A1、ACAN和COMP的mRNA表达，发现三维培养条件下SOX9表达随时间显著上调，FD支架在第14天约达33倍；ACAN在FT支架中第14天较2D第3天增加约4.05倍，高于FD支架；COL2A1在三维培养中第7和14天强烈增强，FT支架表达最高；COMP在FD支架第7天增加更明显，而FT支架第14天表达更高。
3.7 丝素蛋白支架促进软骨生成蛋白表达：通过Western blot评估SOX9和COL2A1蛋白表达，发现三维支架培养以时间依赖方式增强关键软骨生成标志物的蛋白表达；FD支架更强烈促进SOX9蛋白积累，而FT支架支持最高的COL2A1蛋白水平，凸显了支架特异性效应对软骨生成蛋白调控的差异。
讨论部分总结：研究人员在讨论中指出，关节软骨再生仍是重大未解决的临床挑战，丝素蛋白因其生物相容性、可调降解性和多功能加工性成为有吸引力的生物材料。本研究直接比较了由同一5%（w/v）丝素蛋白水溶液通过冷冻干燥和冷冻-解冻两种不同加工路线制备的三维基质，阐明了加工诱导的架构和力学差异如何影响软骨细胞行为。FD支架的高孔隙率和大孔径归因于其更高的溶胀率和蛋白释放；FT支架更致密的网络结构和更高的β-折叠含量与其更高的压缩刚度和更低的溶胀和质量损失一致。从生物学角度，两种三维系统均支持软骨细胞代谢活性，但FD支架更开放的多孔架构有利于传质从而支持更高的代谢活性，而FT支架更受限的微环境和更高的刚度促进了软骨特异性基质成分如II型胶原和聚集蛋白聚糖的合成与积累。SOX9作为软骨生成的核心转录因子在三维培养中持续上调，其下游靶基因COL2A1、ACAN和COMP的mRNA和蛋白水平也相应增加。研究人员指出FD和FT支架的分歧行为可归因于丝素蛋白二级结构、微架构、传质和机械线索的综合影响，而非单一孤立参数。从转化角度看，高度多孔的构建体可能有利于早期细胞定植和代谢活性，而更受限的水凝胶样环境可能支持基质成熟，这种设计策略与软骨组织工程开发功能性修复方案的总体目标一致。
研究结论部分翻译：总之，本研究证明制造路线是丝素蛋白支架工程中的关键设计变量，因为它直接决定支架分子组织、支架架构、水合行为、力学性能以及最终的软骨细胞响应。冷冻干燥支架有利于高度多孔和顺应性微环境，与增加的细胞代谢活性相关；而冷冻-解冻支架产生更致密和更坚硬的结构，更有效地支持软骨特异性标志物和基质相关蛋白的表达。这些发现确定了加工驱动的架构调控作为指导细胞代谢活性与软骨生成成熟之间平衡的有效策略。更广泛地说，它们支持丝素蛋白作为开发软骨再生定制支架系统的多功能平台。
