《Gut Microbes》：Microbial metabolites and MAMPs: orchestrators of intestinal stem cell function
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肠道干细胞（ISCs）对于维持和再生肠道上皮至关重要。近期研究强调了肠道微生物群通过多种分子信号，尤其是微生物代谢物和微生物相关分子模式（MAMPs），调控ISC功能的关键作用。微生物代谢物，如短链脂肪酸（SCFAs）和吲哚类物质，通过影响增殖、分化及整体上皮
肠道干细胞（ISCs）对于维持和再生肠道上皮至关重要。近期研究强调了肠道微生物群通过多种分子信号，尤其是微生物代谢物和微生物相关分子模式（MAMPs），调控ISC功能的关键作用。微生物代谢物，如短链脂肪酸（SCFAs）和吲哚类物质，通过影响增殖、分化及整体上皮更新来调节ISC活动。MAMPs，如脂多糖（LPS）和肽聚糖来源的胞壁酰二肽（MDP），与模式识别受体（PRRs）相互作用，包括Toll样受体（TLRs）和核苷酸结合寡聚化结构域（NOD）样受体（NLRs），从而影响ISC增殖和上皮再生。本综述讨论关于这些微生物信号如何调控ISC功能的新兴证据，并阐明上皮更新与组织修复的机制。全面理解这些宿主-微生物相互作用具有增强上皮再生和恢复肠道稳态的治疗潜力，为新型再生医学策略开辟道路。
引言与ISC及其微环境
肠道上皮依靠吸收营养与水分、构成针对病原体的物理与生化屏障以及调节免疫来维持肠道稳态，在成体中每3-5天完成一次更新，该过程由肠道干细胞（ISCs）驱动。ISCs产生祖细胞，后者进而发育为肠上皮细胞、杯状细胞、肠内分泌细胞和潘氏细胞等特化上皮细胞。ISC的活性与命运受内在遗传程序与周围微环境外源信号（细胞因子、生长因子、共生微生物）共同控制。肠道微生物群通过微生物代谢物和微生物相关分子模式（MAMPs）广泛影响ISC生物学，调节上皮细胞增殖、分化与再生。微生物代谢物如短链脂肪酸（SCFAs）、乳酸和吲哚类物质通过调节增殖与谱系定向影响ISC功能；MAMPs如脂多糖（LPS）和肽聚糖来源的胞壁酰二肽（MDP）与Toll样受体（TLRs）、核苷酸结合寡聚化结构域（NOD）样受体（NLRs）等模式识别受体（PRRs）结合，激活下游分子通路以调节ISC功能与命运决定。
肠道上皮由绒毛与李氏隐窝两个主要区室构成。绒毛由完全分化的上皮细胞组成，这些细胞在隐窝中产生并向上迁移，最终在绒毛顶端因失巢凋亡而脱落。隐窝微环境容纳包含ISC的增殖区室。ISC以隐窝基底柱状（CBC）细胞为特征，活跃循环、寿命长且多能，表达富含亮氨酸重复序列的G蛋白偶联受体5（Lgr5），主要位于隐窝基底上方+1至+3位置，支持自我更新并产生进入短暂扩增（TA）区室的祖细胞。潘氏细胞毗邻ISC，分泌抗菌肽及Wnt3、转化生长因子-α（TGF-α）和Notch配体等关键微环境因子。另一群静息干细胞称为"+4"细胞，表达Bmi1、Hopx和Lrig1等多种标志物，在稳态下不活跃，但可在组织损伤或环境应激时被激活以促进再生。两类干细胞群之间存在相互转化，显示出显著的功能可塑性。近期单细胞谱系示踪研究对Lgr5+ CBC细胞是唯一ISC群体的观点提出质疑，提示ISC潜能分布更为广泛，涵盖参与上皮维持与修复的其他Lgr5阴性群体。
塑造ISC功能的内在信号
ISC命运与活性受多条保守信号通路控制，包括Wnt/β-catenin、Notch、骨形态发生蛋白（BMP）、Hedgehog、表皮生长因子（EGF）、Hippo/yes相关蛋白（YAP）及核因子κB（NF-κB）。经典Wnt/β-catenin通路在调控ISC功能及维持自我更新、增殖与分化平衡中居核心地位，其抑制β-catenin降解，使其积累并转位至细胞核，与T细胞因子/淋巴增强因子（TCF/LEF）转录因子结合激活Wnt应答基因。Wnt/β-catenin信号还促进潘氏细胞成熟，后者产生Wnt3及EGF、Notch配体等生长因子，支持ISC维持所需的局部信号环境。
Notch信号是ISC维持、增殖与谱系特化的另一重要调节者，由单次跨膜受体与Delta/Serrate/Lag2（DSL）家族配体介导，维持ISC干性并引导向吸收性肠上皮细胞谱系分化。经典Notch信号始于DLL1、DLL4等膜结合配体与相邻上皮细胞Notch受体结合，触发受体裂解并释放Notch胞内结构域（NICD），后者转位至核内与转录调节因子RBPJ/CSL结合激活HES1等靶基因。Notch依赖的HES1表达抑制ATOH1，有利于吸收性肠上皮细胞分化，而Notch活性降低则促进分泌型细胞（杯状、潘氏、肠内分泌谱系）分化。Notch还与Wnt/β-catenin信号互作以协调ISC维持与上皮分化。
BMP与Hedgehog通路作为负性调节者，限制ISC增殖并促进分化。BMP经BMP I型与II型受体二聚化信号，导致受体调控SMADs（R-SMADs）磷酸化激活，后者与SMAD4形成异源三聚体复合物转位至核内调控靶基因表达，参与维持肠道稳态并抑制肠道肿瘤发生。Hedgehog信号在肠道主要经旁分泌机制发挥作用，上皮细胞产生的Hedgehog配体作用于间充质细胞，调控其增殖及WNT与BMP配体产生，从而建立上皮-间充质反馈环路。
EGF与Hippo/YAP信号通路调控上皮细胞生长、存活与再生潜能。EGF配体家族经四种ErbB受体信号，激活下游丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）、PI3K-AKT与JAK-STAT通路，促进ISC增殖、上皮再生与肠道稳态维持。Hippo/YAP通路中，核心激酶MST1/2与LATS1/2激活促进YAP与TAZ磷酸化及胞质滞留，而Hippo活性降低则允许YAP/TAZ转位至核内与TEAD转录因子互作，促进干细胞增殖、存活与再生相关基因表达；持续YAP/TAZ激活可促进过度组织生长与肿瘤发生。NF-κB整合免疫与上皮信号，在应激或炎症刺激下将环境线索与ISC功能联系起来，受控的NF-κB信号有助于维持屏障功能与干细胞活性，而长期或失调激活则可能增强炎症反应与异常上皮增殖。
微生物代谢物介导的ISC调控
代谢组学进展拓展了对肠道微生物群代谢输出的认识，其涵盖SCFAs、吲哚类、乳酸及次级胆汁酸等大量生物活性化合物。据人类微生物代谢组数据库（MiMeDB），微生物群落可产生多达15000种不同小分子。这些代谢物可通过改变多种信号通路对ISC产生刺激、抑制或双重效应。微生物代谢物到达肠道上皮的途径包括：由膳食底物生成（如碳水化合物发酵产生SCFAs、微生物色氨酸代谢产生吲哚衍生物）、微生物代谢中间产物（如乳酸，可经种间代谢交叉喂养进一步转化）以及宿主来源分子经微生物修饰（如初级胆汁酸转化为次级胆汁酸）。
膳食底物的微生物转化
SCFAs是含少于六个碳原子、带羧基与烃链的脂肪酸，主要由大肠厌氧菌发酵未消化复杂碳水化合物产生，最常见者为乙酸、丙酸与丁酸，占肠道微生物产生SCFAs的90%。无菌与抗生素处理小鼠模型显示，盲肠与结肠内容物SCFA水平降低与隐窝内肠上皮细胞（IECs）增殖与迁移活性受损相关，而SCFA补充可恢复抗生素处理小鼠的IEC增殖与迁移。体外类器官研究进一步表明，单一SCFAs增强类器官生长，混合SCFA效果最显著。SCFAs作为GPR41与GPR43配体呈剂量依赖性作用，药理学激活这些受体可促进小鼠肠道类器官发育。给予产生乙酸与丙酸的嗜黏蛋白阿克曼菌可加速小鼠Lgr5+ ISC增殖，其盲肠内容物增强小肠类器官形成，该效应可被GPR41/43拮抗剂消除。此外，母体肠道微生物群组成及其相关代谢物可影响子代ISC群体，产生持久功能效应；母体SCFAs与氨基酸水平升高在子代ISC的雷帕霉素机制靶点（mTOR）通路上留下独特转录组印记，妊娠期药理学抑制mTOR可逆转这些微生物驱动的效应。
微生物来源丙酸与调控ISC干性及恢复ISC标志物表达相关。饮水给予丙酸可显著减轻葡聚糖硫酸钠（DSS）相关组织损伤并增强隐窝增殖，丙酸处理可逆转DSS诱导的类器官ISC标志物Olfm4与Lgr5表达下降。丙酸或丙酸处理促进类器官发育，增加Lgr5+ ISC数量，EdU检测与Ki-67标记进一步证明这些处理刺激类器官隐窝细胞增殖。
值得注意的是，SCFAs亦可抑制ISC及其微环境细胞增殖。盲法筛选发现，丁酸在生理相关浓度下是肠干/祖细胞增殖的强效抑制剂，该效应在体外及体内（DSS诱导小鼠结肠损伤或外源丁酸处理斑马鱼）均表现为细胞增殖显著抑制与伤口愈合受损。机制上，丁酸介导的抑制作用可被抑制转录因子Foxo活性所逆转，结肠干/祖细胞中敲除Foxo3（而非Foxo1）可消除丁酸抑制作用。丁酸是相对强效的内源性组蛋白去乙酰化酶（HDAC）抑制剂，并可通过结肠细胞氧化消耗氧而贡献生理性低氧上皮环境，激活缺氧诱导因子（HIF）依赖通路。丁酸对肠道上皮增殖的效应呈背景与剂量依赖性，低浓度倾向促进上皮代谢与增殖，高浓度则可产生抑制作用。总体而言，丁酸的促增殖或抑制效应取决于其局部可利用性与对ISC微环境的可及性，以及上皮细胞的代谢状态与分化程度。
吲哚类是吲哚衍生物，其核心为吡咯环与苯环稠合，作为信号分子与代谢中间体影响情绪、睡眠、昼夜节律、肠道屏障功能、免疫调节及神经内分泌过程。色氨酸是吲哚的主要前体，肠道微生物群将约4-6%的总摄入色氨酸分解为吲哚-3-乙酸（I3A）与吲哚-3-醛（I3Ald）等吲哚类物质，这些吲哚在维持肠道稳态中具有双重作用。吲哚影响肠道上皮生物学的主要机制是芳香烃受体（AhR），一种配体激活转录因子，配体结合后调控上皮屏障完整性、免疫稳态与细胞分化相关基因。在ISC生物学中，AhR信号呈配体与背景依赖性，可与Wnt/β-catenin及Notch等关键通路互作。例如，吲哚-3-甲醇经AhR依赖的Wnt与Notch信号调控促进杯状细胞分化，而I3Ald激活AhR并改善实验性结肠炎中的上皮屏障功能与再生。
近期研究表明I3A能显著抑制ISC增殖与更新。放射抗性不动杆菌来源外膜囊泡（OMVs）显著减少EdU+细胞数，而缺乏I3A产生的ΔtrpC突变株OMVs不能抑制类器官增殖，证实I3A对这些囊泡抗增殖活性的必要性；该I3A依赖性抑制在人肠道类器官中亦被观察到。OMVs或I3A下调Wnt靶基因c-Myc、Cyclin D1与Ascl2表达，并减少Axin2+ ISC比例，提示I3A是Wnt信号的特异性微生物抑制因子。慢性束缚应激小鼠模型显示，心理应激诱导鼠乳杆菌产生I3A，经ISC内在机制损害ISC谱系定向，精神困扰患者粪便I3A水平升高。单细胞RNA测序显示I3A处理类器官中ISC向分泌谱系定向减少、线粒体完整性相关基因失调及氧化磷酸化（OXPHOS）能力受损。类似地，吲哚-3-甲醇抑制肠道类器官形成，最可能通过抑制ISC增殖。相反，I3Ald在仔猪与小鼠模型中促进ISC分化与增殖，猪肠道类器官中I3Ald显著增加出芽效率与类器官表面积并上调Lgr5。近期还描述了吲哚-3-丙酸（IPA）与吲哚-3-乳酸（ILA）在ISC介导上皮修复中的新作用：球形梭菌来源ILA可经交叉喂养被转化为IPA，导致上皮β-羟丁酸（BHB）产生、激活HOPX+储备ISC、恢复Lgr5+ ISC池并改善黏膜愈合；IPA激活IEC中PPARα、诱导HMGCS2表达、增加BHB产生，从而促进Lgr5+ ISC依赖的再生。
微生物代谢产物与交叉喂养
乳酸是肠道微生物代谢网络中的重要中间代谢物，主要由乳酸菌（LAB）发酵葡萄糖、蔗糖等简单碳水化合物产生，可被其他微生物消耗或转化。乳酸可作为信号分子经GPR81与Wnt/β-catenin通路影响IEC与ISC。猪空肠上皮类器官中乳酸处理48小时呈剂量依赖性显著增加类器官生长与增殖；机制上乳酸以GPR81依赖方式激活Wnt/β-catenin信号促进ISC介导的上皮增殖。口服LAB使Lgr5-GFP小鼠隐窝高度增加，小肠Lgr5+ ISC、潘氏细胞、杯状细胞、Ki-67+增殖细胞与Olfm4+细胞数量升高，小肠与大鼠乳酸水平显著增强；益生菌培养上清或乳酸培养的小肠隐窝产生更大类器官与更高Lgr5+ ISC计数，Wnt/β-catenin相关基因表达显著增加。乳酸对ISC增殖的效应在新生小鼠小肠类器官中显著大于成年小鼠。给予乳酸可保护小鼠免受放疗与化疗所致显著肠道损伤，保障Lgr5+ ISC存活。然而乳酸对肠道稳态的效应呈背景依赖性，生理浓度可支持上皮再生与调节免疫应答，而缺氧或炎症组织中持续乳酸积累常伴随细胞外酸化与炎症信号改变，其效应随浓度、细胞背景、代谢状态与暴露时长而异。
宿主来源分子的微生物修饰
初级胆汁酸在肝脏产生，作为乳化剂助小肠脂肪消化，大部分经肠肝循环重吸收，小部分进入结肠，经微生物作用生成次级胆汁酸，人类主要为脱氧胆酸（DCA）与石胆酸（LCA）。高脂饮食21天小鼠十二指肠样本ISC标志物Lgr5表达增加，伴粪便胆汁酸积累；新鲜分离小鼠肠道隐窝暴露于粗胆汁提取物或次级胆汁酸（DCA或LCA）6天显著促进新生隐窝生长，而高剂量LCA导致类器官计数显著下降，提示胆汁酸对ISC活性的作用呈剂量依赖性。胆汁酸响应膜受体Takeda G蛋白偶联受体5（TGR5，又称GPBAR1）在肠道表达并调节多种生理功能；Lgr5+ ISC中破坏TGR5的小鼠DSS诱导结肠炎较对照严重，而TGR5激动剂INT-777处理ISC增强YAP1及其上游调节因子原癌基因酪氨酸蛋白激酶Src（SRC）激活，YAP1与SRC抑制剂可抑制TGR5激活所致类器官发育。总体而言，胆汁酸说明微生物代谢可重塑宿主来源信号池，微生物贡献不仅是产生代谢物，更是将宿主来源分子生物转化为化学与生物学上不同的信号分子集合，经TGR5及SRC、YAP等下游通路直接影响ISC更新与上皮修复。
微生物对ISC的效应高度依赖背景，随代谢物浓度、肠道区域、上皮损伤、炎症、年龄与饮食而变化。例如丁酸在生理条件下支持上皮代谢，但当其更多进入隐窝区室时可抑制ISC/祖细胞增殖；次级胆汁酸在适当浓度下经TGR5信号促进再生，但过量则损害上皮生长。ISC反应性亦随发育阶段变化，乳酸对新生类器官的促增殖反应大于成年类器官。饮食通过改变微生物底物可利用性与代谢物产生进一步影响这些反应。因此，促进急性损伤后修复的信号在稳态或慢性炎症中可能效应有限或不利，尤其在易发肿瘤的背景中。这些发现凸显了在评估微生物来源信号作为ISC功能调节者或治疗靶点时，剂量、空间分布、时机与宿主背景的重要性。
MAMP驱动的ISC调控
MAMPs是多种微生物（包括共生菌与病原体）中保守的分子，如LPS、肽聚糖、细菌脂蛋白、CpG DNA基序与鞭毛蛋白，这些结构不存在于真核宿主细胞中，在先天与适应性免疫中起关键作用。MAMPs由TLRs与NLRs等PRRs识别，主要表达于抗原呈递细胞（APCs）与上皮细胞。MAMP-PRR相互作用亦参与塑造ISC的表型与功能特征。
TLRs是进化上保守的I型跨膜蛋白，包括胞外域、跨膜区与胞质Toll-白介素（IL）-1受体（TIR）域；含亮氨酸富集重复序列（LRRs）的胞外域识别MAMPs，TIR域激活下游信号。TLR介导通路经髓样分化初级应答88（MyD88）依赖或非依赖途径发挥作用，激活NF-κB与MAPK等关键转录调节因子，最终产生促炎细胞因子、趋化因子与抗菌肽。TLR-MAMP相互作用通过调节健康上皮屏障、上皮再生、免疫耐受与宿主先天防御维持肠道稳态。有研究报道TLR2、4、5、7、9在ISC上无特异性表达，但其他多项研究指出TLRs尤其是TLR4与TLR2在调控ISC功能中的重要作用。多色流式细胞术与荧光原位杂交显示TLR4在小鼠肠道隐窝及Lgr5+ ISC上组成性表达，小鼠肠上皮过表达TLR4导致Lgr5+干细胞与增殖增加。相反，肠道微生物群纯化的LPS显著降低主要由Lgr5+ ISC组成的肠道类器官生长；注射LPS不仅增强隐窝内凋亡（cleaved caspase-3表达增加），还减少隐窝细胞增殖（BrdU掺入减少），TLR4?/?小鼠未出现这些效应，证实LPS诱导的隐窝凋亡与再生依赖TLR4信号；Lgr5+ ISC靶向敲除TLR4可抑制LPS诱导的凋亡与增殖。TLR4-LPS信号通过PUMA发挥作用的证据显示，PUMA?/?小鼠未出现LPS所致凋亡增加与增殖减少，TLR4在隐窝中诱导PUMA依赖TRIF而非MyD88，PUMA缺失可防止小鼠发生坏死性小肠结肠炎（NEC）并逆转对隐窝凋亡与增殖的负面影响。TLR4引起内质网（ER）应激，促进Lgr5+ ISC凋亡，提示新生儿肠道ER应激增加导致NEC易感性。
TLR2参与促进ISC再生。口服鼠李糖乳杆菌GG（LGG）在TLR2?/?或环氧合酶-2（COX-2）?/?小鼠中不能保护肠道免受辐射，提示LGG辐射防护涉及TLR2与COX-2依赖的前列腺素E2（PGE2）产生。TLR2还可诱导潘氏细胞与杯状细胞等ISC微环境细胞再生。TLR2与NOD2激动剂CL429经激活TLR2-MyD88-NF-κB通路对辐射诱导肠道损伤提供保护。CL429处理后受照小鼠肠道BrdU+细胞、Lgr5+ ISC与Olfm4+ ISC多于对照；受照Lgr5-EGFP-IRES-creERT2小鼠类器官Lgr5+ ISC显著减少，而CL429处理显著增加其丰度；TLR2?/?小鼠CL429对YAP1激活减弱，支持CL429经激活TLR2-YAP1促进ISC再生。
NLRs是胞质内受体家族，包括感知MAMPs并调控宿主先天免疫的NOD1与NOD2。NOD2是NLR家族重要成员，作为细菌肽聚糖保守最小基序MDP的受体，在宿主防御、自身免疫与自噬中起重要作用。NOD2在ISC中较其他肠上皮细胞组成性且独特表达。类器官研究显示TLR2、TLR4、TLR5、TLR9或NOD1激动剂对类器官生长无影响，而选择性激活NOD2显著增加类器官形成数量而非大小；Lgr5+ ISC伴或不伴潘氏细胞培养中NOD2激动剂刺激均增强类器官生长；NOD2?/?小鼠经多柔比星（诱导氧化应激与ISC损伤）处理细胞死亡增加，表明MDP经NOD2信号在应激条件下维持ISC活力中发挥细胞保护作用。肠上皮细胞（含ISC）中NOD2对植物乳杆菌WJL诱导的小肠隐窝Ki-67+增殖细胞增加不可或缺，并与慢性营养不良期间幼鼠小肠绒毛更长及全身生长改善相关。机制研究显示MDP处理抑制ISC内总ROS与线粒体ROS，伴线粒体自噬诱导；ATG16L1或NOD2敲除小鼠来源类器官不能显示MDP驱动的细胞保护，体内亦证实MDP-NOD2通路诱导线粒体自噬；NOD2?/?小鼠受照后类器官形成显著低于野生型，提示NOD2促进辐射损伤后隐窝存活与肠上皮再生。总体而言，NOD2介导的细胞保护机制涉及通过线粒体自噬清除有害过量ROS，由NOD2与ATG16L1同步激活经NF-κB非依赖通路启动。
总体而言，TLR4、TLR2与NOD2并非独立微生物感知通路，而是形成相互连接的网络，决定肠道炎症、抗菌防御与上皮修复之间的平衡。稳态下相对受控的TLR2信号有助于屏障完整性与微生物耐受，而屏障破坏或菌群失调时过度或失调的TLR4激活可促进LPS驱动的NF-κB与MAPK依赖炎症信号。TLR2与NOD2亦可贡献保护性肠道反应，包括上皮屏障功能、抗菌防御与组织保护；NOD2信号可调节TLR介导的炎症反应，在胞内感知细菌肽聚糖来源MDP与细胞表面识别微生物产物之间提供调控联系。菌群失调或感染时，生物学结局可能不取决于单一受体激活，而取决于多种模式识别通路的强度、时机、细胞背景、定位与协调。需注意细菌成分还可经免疫与基质细胞间接调节ISC功能，影响干细胞微环境。
微生物群-ISC相互作用：对IBD与肿瘤发生的意义
炎症性肠病（IBD）以慢性黏膜炎症、上皮屏障功能障碍及肠道微生物群组成与代谢活性改变为特征。由于ISC持续响应其微环境中上皮、免疫、基质与微生物成分的信号，疾病相关微环境变化可能改变正常调控ISC增殖与分化的信号。肠道炎症期间微生物群-ISC微环境显著重塑，微生物代谢物与微生物来源信号可直接或经微环境其他成分间接影响上皮再生。微生物群落组成改变可修改SCFAs、吲哚衍生物、乳酸与次级胆汁酸等代谢物的产生与可利用性，而上皮屏障破坏可能增加宿主细胞对微生物产物的暴露，这些变化可影响Wnt/β-catenin、Notch、YAP、NF-κB及TLR、NOD等受体介导通路。微生物信号依浓度、持续时间、细胞靶标与代谢背景可产生相反效应，例如TLR2与NOD2信号可贡献上皮保护与再生，而LPS过度激活TLR4可经PUMA依赖机制促进ISC凋亡并减少隐窝增殖。因此菌群失调可能并非简单增加或减少ISC活性，而是扰乱适当上皮更新所需微生物信号的平衡与时机。
微生物群-ISC相互作用亦可能与肠道肿瘤发生相关。Wnt/β-catenin、Notch、EGFR与YAP等ISC相关通路对生理性上皮更新至关重要，但持续或组成性激活时可促进异常增殖。由于Wnt信号是ISC维持的核心决定因素且在结直肠肿瘤发生中常失调，汇聚于该通路的微生物与炎症信号改变可能影响遗传改变上皮群体的行为。慢性炎症可创造上皮更新增加、炎症信号增强与细胞应激的环境，可能有利于携带致癌改变细胞的扩增。新兴证据提示特定细菌可与干细胞样上皮或结直肠癌干细胞群体互作，例如具核梭杆菌与结直肠癌相关，并据报道影响干细胞样特性与促肿瘤信号，但这些效应在多大程度上涉及正常ISC与转化或癌干细胞仍是重要研究方向。因此，微生物相关肿瘤发生效应不应简单解释为ISC增殖增加的结果，而应视为微生物信号、上皮遗传改变、炎症通路与周围组织微环境相互作用的结果。总体而言，这些观察提示微生物代谢物与MAMPs调控ISC功能的生理机制在微生物环境、上皮屏障等发生病理改变时可能具有病理相关性。
