《Bioengineering》：An Autologous Dermal–Epidermal Composite Engineered Skin Repairs Wounds in a Pig Model
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（1）背景：网状刃厚皮片移植（SSG）仍是深部创面治疗的金标准。本研究旨在采用具有临床相关性的两阶段移植方案，在猪模型中评估自体生物工程化真皮-表皮复合皮肤对全层创面的治疗作用。（2）方法：在动物背侧制作多个全层创面。创面先以聚氨酯真皮模板移植，三周后分别移植
（1）背景：网状刃厚皮片移植（SSG）仍是深部创面治疗的金标准。本研究旨在采用具有临床相关性的两阶段移植方案，在猪模型中评估自体生物工程化真皮-表皮复合皮肤对全层创面的治疗作用。（2）方法：在动物背侧制作多个全层创面。创面先以聚氨酯真皮模板移植，三周后分别移植血小板水凝胶-猪皮肤等效物（PG-PSE）或网状SSG作为对照。同时评估人血小板裂解液作为皮肤成熟过程中胎牛血清替代物的可行性。（3）结果：移植后两周，PG-PSE处理创面的表皮化程度与SSG处理创面相当。EdU标记证实了移植物的早期植入以及移植物来源细胞对新表皮和新真皮的贡献。细胞角蛋白5（CK5）免疫荧光染色显示新表皮呈过度增殖状态，富集祖细胞型角质形成细胞，为猪早期皮肤移植的典型表现。新真皮以丰富的波形蛋白（vimentin）+成纤维细胞和网嵴为特征，提示真皮-表皮交界成熟。浅层与深层新真皮均观察到显著的血管新生，其中以血小板裂解液成熟的移植物在浅层新真皮中形成的微血管多于天然皮肤。天狼星红染色显示，与SSG相比，PG-PSE移植物浅层新真皮中粗大的红色胶原纤维丰度较低，符合PG-PSE中胶原沉积与组织整合仍在进行的特点。然而，深层新真皮中细绿色胶原纤维与粗红色胶原纤维的比值在各组间基本相当，提示生物工程化移植不改变真皮模板的成熟过程。（4）结论：总体而言，自体真皮-表皮生物工程化皮肤可在真皮模板上有效实现血管化并修复创面。血小板裂解液是胎牛血清的有前景替代物，但PG-PSE可能需要更长时间才能实现完整的真皮成熟，值得进一步长期评估。
一、研究背景与问题提出
深部全层创面的修复一直是临床难题，网状刃厚皮片移植（SSG）虽为金标准，但存在供区损伤与来源受限等问题。猪皮肤在表皮厚度、网嵴结构、皮下脂肪及血管网络等方面与人皮肤高度相似，且创面以再表皮化方式愈合而非收缩，因此是理想的创面修复模型。研究人员此前已证明，将人成纤维细胞与角质形成细胞接种于血小板材料水凝胶可构建血小板水凝胶-人皮肤等效物（PG-HSE），并在免疫缺陷裸鼠中实现有效创面闭合。然而，异种移植模型难以反映免疫健全条件下的移植整合与重塑过程，且缺乏对移植细胞命运的直接追踪证据。为此，本研究在免疫健全的大型白猪中构建自体生物工程化皮肤，并模拟临床深部创面的两阶段治疗流程开展评估，以弥补上述不足。
二、研究设计与主要结论
研究人员在5只2–3月龄雌性大型白猪背侧制作多个全层创面，先移植Novosorb?可生物降解临时基质（BTM）作为真皮模板，三周后分别移植自体血小板水凝胶-猪皮肤等效物（PG-PSE，分为无血清血小板裂解液成熟组与含血清成熟组）或网状SSG对照。结果显示，自体真皮-表皮生物工程化皮肤能够在真皮模板上有效血管化并修复创面，其表皮化程度与金标准SSG相当；血小板裂解液可作为胎牛血清的有前景替代物，但PG-PSE的完整真皮成熟可能需要更长时间。该研究为自体工程化皮肤的规模化、临床相关生产及其在严重烧伤、重建外科缺损等广泛皮肤缺损中的应用提供了可行性证据，同时建立了可用于研究移植后创面修复细胞与分子通路的猪模型。
三、关键技术方法
研究采用的主要技术包括：自体猪角质形成细胞与真皮成纤维细胞的分离与体外扩增；以人血小板沉淀经凝血酶形成血小板水凝胶（PG）支架，依次接种成纤维细胞与基底角质形成细胞，并在气-液界面成熟构建PG-PSE；采用5-乙炔基-2′-脱氧尿苷（EdU）对三维移植物进行DNA标记以追踪移植细胞；建立两阶段外科手术模型（真皮模板移植后二次移植）；以及苏木精-伊红染色、Masson三色染色、天狼星红染色与CD31、CK5、波形蛋白、CD45等免疫荧光染色结合图像定量分析。样本来源为5只雌性大型白猪（S. domesticus），人血小板沉淀购自澳大利亚红十字会生命血液中心。
四、研究结果
3.1 自体生物工程化皮肤移植治疗猪全层创面：所有创面先以BTM真皮模板移植，三周后移植PG-PSE或网状SSG。体外苏木精-伊红染色显示无血清与含血清成熟的PG-PSE结构相似；移植后14天，PG-PSE移植区实现表皮化，与SSG相当，两种培养条件间无宏观差异。
3.2 移植角质形成细胞形成可追踪的新表皮：EdU标记细胞分布于PG-PSE全层，无血清组标记细胞较多，可能与细胞增殖周转较慢有关。移植后第7天，两种PG-PSE中均检出标记的角质形成细胞与成纤维细胞；至第二周EdU信号基本消失，第1周可见CD45+清道夫细胞浸润，提示早期免疫介导的碎片清除。
3.3 生物工程化皮肤形成富集祖细胞角质形成细胞并具网嵴结构的新真皮与新表皮：PG-PSE与SSG均表现为表皮增厚，CK5信号扩展至表皮全层，而天然猪皮肤仅局限于基底层；新真皮中波形蛋白+成纤维细胞丰富，并形成伸入真皮的网嵴结构，提示真皮-表皮交界逐步成熟。
3.4 血管新生支持移植物存活：移植后两周，浅层新真皮可见大量微血管。无血清血小板裂解液成熟组浅层新真皮微血管密度显著高于未损伤天然皮肤（p = 0.0461），且直径10–20 μm血管显著增多（p = 0.0154）；含血清组深层新真皮中5–10 μm（p = 0.0083）与10–20 μm（p = 0.0068）血管显著多于天然皮肤。BTM植入五周后，两组深层新真皮仍可见残留碎片。
3.5 胶原沉积与重塑：Masson三色染色显示各移植组胶原较天然皮肤疏松；浅层新真皮中SSG胶原量显著高于两种PG-PSE，且所有组均低于未损伤皮肤；深层新真皮各组间无显著差异但均低于天然皮肤。天狼星红染色显示，SSG浅层新真皮粗大/混合胶原纤维显著多于两种PG-PSE（p = 0.0027、p = 0.0009），细纤维量各组相近；深层新真皮胶原纤维组成在各组与天然皮肤间无显著差异，提示无论采用SSG还是PG-PSE，深层真皮重塑方式相似。
五、讨论与结论
讨论指出，本研究为可行性研究，动物数量较少是主要局限，但内置自身对照降低了猪间个体差异的影响。生物工程化皮肤与SSG均出现表皮增厚及CK5向表皮上层扩展，反映移植整合期角质形成细胞增殖活跃；两种PG-PSE均在两周内形成网嵴，而裸鼠模型中未见网嵴。血小板裂解液成熟组浅层新真皮血管化更优，其长期瘢痕后果尚待确定。PG-PSE浅层新真皮粗胶原纤维较少，提示其胶原沉积与整合阶段可能延长，需长期研究评估真皮力学稳定性、收缩与重塑。按照良好生产规范（GMP）要求，以血小板裂解液替代胎牛血清，消除了终末生产阶段的动物源成分。与denovoSkin?和SASS等同类产品相比，PG-HSE具有人血小板水凝胶支架固有的促血管化、促表皮化及抗菌优势，且规模化生产约需3周，短于SASS的6周。
结论译文：总体而言，这些数据证明了对大型全层创面治疗用自体生物工程化皮肤进行可规模化、临床相关生产的可行性。该研究为新型自体生物工程化皮肤有效修复深部创面提供了一定的临床意义证据，并有望应用于治疗广泛皮肤缺损，如严重烧伤、重建外科缺损和巨大先天性黑色素细胞痣。此外，该猪模型可用于研究皮肤移植后创面修复所涉及的细胞与分子通路；加深对创面修复与再生调控机制的理解，可支持皮肤生物工程学的未来发展。
