匍匐翦股颖转录因子AsMYB44过表达增强耐荫性的生理与分子机制

《Agriculture》：Microbial Consortium Inoculation Increases Arbuscular Mycorrhizal Colonization and Selectively Alters Soil Microbial Functioning Without Consistent Yield Gains in Tomato Crops

　　

遮荫胁迫是限制植物生长发育的主要非生物因素之一，其影响主要通过光合途径实现，这一效应在生长于大树和建筑物阴影下的草坪草中尤为显著。MYB转录因子在植物光合作用中发挥关键作用，多个MYB成员参与植物的遮荫响应。然而，MYB44在植物遮荫响应中的功能尚未见报道。本研究中，研究人员发现过表达AsMYB44的匍匐翦股颖（creeping bentgrass）在遮荫胁迫下叶绿素a（chlorophyll a）、叶绿素b（chlorophyll b）、类胡萝卜素（carotenoid）含量、净光合速率（net photosynthetic rate，Pn）及抗氧化酶活性均有所提高。转录组分析显示，AsMYB44过表达显著上调了与光合作用（photosynthesis）、光合天线蛋白（photosynthesis antenna proteins）和叶绿素代谢（chlorophyll metabolism）通路相关基因的表达。综上，这些结果表明过表达AsMYB44提高了匍匐翦股颖的耐荫性。研究人员的发现为植物耐荫性育种提供了重要的候选基因资源。

研究背景、现存问题与研究目的

光是植物光合作用的能量来源，也是植物生长与代谢的基础。遮荫作为一种普遍存在的非生物胁迫，严重影响植物的生长发育和生理代谢过程。在城市绿地、林下区域和高尔夫球场等环境中，草坪草经常遭受不同程度的遮荫胁迫。在美国，处于遮荫条件下的草坪面积占总草坪面积的25%，而在中国这一比例约为50%。因此，遮荫胁迫是草坪草产业的核心问题之一，培育耐荫草坪草品种对于有效解决这一问题至关重要。

MYB型转录因子含有一个保守的DNA结合结构域——MYB结构域，由数量不等的非完美重复序列组成。在拟南芥鉴定的196个MYB转录因子中，126个属于R2R3-MYB家族，其MYB结构域包含两个重复序列R2和R3。近年研究表明，MYB转录因子在遮荫信号通路中发挥重要作用，例如AtMYB30在遮荫下转录水平显著下调，CsMYB7和CsMYB4在茶树遮荫条件下表达显著上调，而VvMYB12在葡萄遮荫下显著下调。MYB44作为R2R3-MYB转录因子家族的成员，在生物胁迫、非生物胁迫及代谢调控中发挥重要作用，已被证实参与干旱耐受性、盐胁迫耐受性、冷胁迫及叶片衰老调控等多个过程。然而，MYB44在植物遮荫响应中的确切作用尚不清楚，亟需进一步探索。匍匐翦股颖是一种冷季型草坪草，具有生长快、叶片纤细、再生能力强、耐低修剪等优点。本研究旨在探究过表达AsMYB44是否能增强匍匐翦股颖的耐荫性，为草坪草及作物的耐荫性育种提供科学依据和重要候选基因资源。

主要关键技术方法

1. 1.
   生物信息学分析：利用BioXM软件搜索AsMYB44基因开放阅读框（ORF），通过BLASTP在NCBI数据库中检索同源蛋白，使用MEGA 7.0软件采用最大似然法（ML）构建系统发育树，选择Tamura 3-parameter + Gamma分布模型，Bootstrap值设定为1000次重复。
2. 2.
   载体构建与遗传转化：从匍匐翦股颖全长转录组数据中筛选AsMYB44同源序列，经PCR扩增后克隆至pTOPO-Blunt载体，再重组至pENTR1A骨架，最终通过Gateway重组转入改良pCAMBIA1305.2载体获得pCAMBIA1305.2-AsMYB44。以成熟种子为外植体诱导愈伤组织，采用农杆菌介导法进行遗传转化，获得过表达AsMYB44的转基因株系。
3. 3.
   亚细胞定位与转录活性分析：将AsMYB44编码序列（CDS）构建至pCAMBIA1302-GFP载体，通过农杆菌注射法在本氏烟草叶片中瞬时表达，利用共聚焦显微镜观察荧光定位。同时通过酵母双杂交（Y2H）系统和双荧光素酶报告系统检测AsMYB44的转录活性。
4. 4.
   生理指标测定：测定叶绿素a（Chla）、叶绿素b（Chlb）、类胡萝卜素（Car）含量及叶绿素a/b比值；使用便携式光合仪记录气体交换参数包括胞间CO₂浓度（Ci）、蒸腾速率（Tr）、净光合速率（Pn）和气孔导度（gs）；测定超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）、过氧化氢酶（CAT）活性及丙二醛（MDA）含量和电解质渗漏率（EL）。
5. 5.
   转录组测序与分析：对野生型（WT）和AsMYB44过表达株系（OE1和OE2）的叶片样品进行RNA测序（RNA-seq），委托广州基迪奥生物进行文库构建和Illumina测序。使用Trinity进行从头组装，Salmon进行reads比对和定量，edgeR进行差异表达分析，筛选标准为|log₂ fold change| > 1且FDR < 0.05。对差异表达基因（DEGs）进行GO和KEGG富集分析。

研究结果

3.1 AsMYB44的系统发育分析与亚细胞定位

研究人员通过系统发育分析发现，匍匐翦股颖AsMYB44与硬直黑麦草LrMYB44、多年生黑麦草LpMYB44和多花黑麦草LmMYB44亲缘关系最近，且AsMYB44及其同源蛋白均含有保守的R2R3-MYB结构域。亚细胞定位实验表明，AsMYB44-GFP融合蛋白的荧光与DAPI荧光在烟草细胞核中重叠，证明AsMYB44蛋白定位于细胞核。

3.2 AsMYB44在植物细胞中作为转录抑制子发挥作用

酵母双杂交实验显示，BD和BD-AsMYB44组合的酵母细胞在SD/TRP培养基上正常生长，但在SD/HIS/TRP培养基上无法生长，表明AsMYB44蛋白在酵母系统中不具备转录激活活性。双荧光素酶报告实验表明，AsMYB44-GAL4DB组的荧光强度显著低于GAL4-LUC组，说明AsMYB44在烟草细胞中具有转录抑制活性。

3.3 AsMYB44的组织特异性表达、遮荫响应及遗传转化鉴定

RT-qPCR分析显示，AsMYB44在匍匐翦股颖不同组织中的表达量以叶片最高，根次之，匍匐茎最低，其中根和叶片的表达量分别为匍匐茎的4.47倍和9.56倍。野生型植株在遮荫处理6小时和8小时后，AsMYB44表达量分别较0小时上调11.35倍和9.52倍，表明其对遮荫胁迫具有显著响应。四个过表达株系OE1、OE2、OE3和OE4中AsMYB44的表达量分别为WT的6.09、4.69、3.26和3.43倍，均显著高于野生型。PCR验证结果显示，转基因株系和质粒对照组均获得了目标DNA片段（923 bp），而WT未获得该片段。

3.4 过表达AsMYB44对遮荫胁迫下匍匐翦股颖生长、光合能力和抗氧化系统的影响

表型分析显示，正常光照下过表达株系的叶片宽度显著小于WT，如OE1减少22.6%。遮荫处理后，WT的绿叶率下降83.8%，而OE1仅下降31.7%。光合色素方面，遮荫使WT的Chla、Chlb和Car含量分别降低62.9%、80.5%和54.9%，而OE1仅分别降低16.2%、34.4%和16.5%。气体交换参数方面，遮荫导致WT的Pn、gs和Tr分别下降91.5%、56.0%和64.0%，而OE1仅分别下降51.4%、23.5%和35.3%。遮荫使WT的Chla/b比值和Ci分别增加90.9%和38.2%，而OE1仅增加27.7%和21.2%。抗氧化系统方面，遮荫使WT的SOD、POD和CAT活性分别下降83.9%、97.2%和86.8%，而OE1仅分别下降47.8%、66.5%和11.8%。遮荫使WT的MDA含量和EL分别升高6.7倍和8.6倍，而OE1仅升高2.6倍和2.9倍。在遮荫处理下，过表达株系的所有上述指标均显著优于WT。

3.5 差异表达基因的富集与特征分析

主成分分析和相关性热图显示，过表达株系（OE1和OE2）与WT之间组间差异显著，组内重复性好。OE1 vs. WT共鉴定出58,623个差异表达基因（DEGs），其中17,038个下调，41,585个上调；OE2 vs. WT共鉴定出59,067个DEGs，其中18,172个下调，40,895个上调，两组比较共有55,204个DEGs重叠。GO富集分析显示，最显著富集的条目与蛋白质合成和翻译相关，包括核糖体、翻译和核糖体结构组分，此外叶绿素合成和能量代谢相关条目如四吡咯结合和血红素结合也高度富集。KEGG富集分析表明，最显著富集的通路是核糖体，其次是与胁迫适应和次生代谢相关的通路，包括次生代谢物生物合成、苯丙烷生物合成以及亚油酸代谢和α-亚麻酸代谢等脂质代谢通路。与WT相比，过表达株系中光合作用通路相关基因显著上调，包括光系统II的19个基因（如AsPsbA、AsPsbB、AsPsbC等）、光系统I的11个基因（如AsPsaA、AsPsaD、AsPsaE等）、细胞色素b6/f复合体的3个基因（AsPetA、AsPetB、AsPetC）、光合电子传递蛋白的13个基因（如AsPetE、AsPetF、AsPetH）以及F型ATP酶亚基的6个基因（如AsAtpF、AsAtpD等）。光合天线蛋白通路中，光系统I捕光复合体叶绿素a/b结合蛋白有8个基因上调（如AsLHCA1-5），光系统II捕光复合体叶绿素a/b结合蛋白有62个基因上调（如AsLHCB1-7）。叶绿素代谢通路中，共富集到18个DEGs，其中12个上调（如AsHemC、AsHemD、AsHemL、AsChlI、AsChlM、AsChlE、AsChlG、AsCAO等），6个下调（如AsNOL、AsSGR等）。qRT-PCR验证结果与转录组数据一致，AsPIL15和AsSGR表达下调，AsPsaD、AsPsaE、AsPsaH、AsPHYB、AsPSY3、AsCAO、AsLHC3和AsLHC4表达上调。

讨论总结与结论

讨论部分指出，MYB44作为R2R3-MYB转录因子家族成员，在植物生物与非生物胁迫响应及代谢调控中发挥关键作用。本研究发现AsMYB44在遮荫处理后6小时和8小时转录水平显著升高，提示其参与遮荫胁迫响应通路。组织特异性表达分析显示其在叶片中表达最高。在正常光照下，过表达株系叶片宽度显著小于WT，这可能是由于AsMYB44负调控细胞伸长和分裂所致，这种看似不利的形态变化在遮荫条件下反而可能具有适应性优势——窄叶可减少相互遮荫，使更多入射光穿透至下层冠层。遮荫条件下，过表达株系的光合色素和气体交换参数维持较高水平，Chla/b比值增幅较小，表明更平衡的两个光系统化学计量关系。抗氧化系统方面，过表达株系维持了更高的SOD、POD和CAT活性，有效限制了MDA积累和电解质渗漏，这与之前某些MYB转录因子负调控抗氧化酶基因的研究结果不同，体现了MYB介导调控网络的复杂性。转录组分析揭示，过表达AsMYB44主要增强了光合作用、光合天线蛋白和叶绿素代谢通路相关基因的表达，暗示AsMYB44可能通过激活捕光复合体基因和叶绿素生物合成酶基因，维持有限光照下的高效能量捕获和电子传递。机制上，AsMYB44可能作用于遮荫响应模块的上游，维持叶绿体和光合基因表达的同时抑制叶绿素降解。AsPIL15和AsSGR的下调以及AsPHYB的上调提示光/遮荫信号改变和叶绿素降解延迟。未来研究应整合CRISPR/Cas9敲除或RNAi敲低、ChIP-seq和DAP-seq结合EMSA和双荧光素酶实验鉴定直接靶标、多时间点转录组-蛋白质组-代谢组联合分析、ROS成像、叶绿素荧光测量以及多季节田间试验等手段。

研究结论：AsMYB44调控植物的耐荫性。过表达AsMYB44增强了匍匐翦股颖的耐荫性，体现在植株形态、光合能力和抗氧化酶活性方面。更重要的是，AsMYB44可能间接维持了光合作用、光合天线蛋白和叶绿素代谢相关基因的表达。