基于FRET优化的杂合脂质体–U87MG细胞膜纳米囊泡增强伊立替康（Irinotecan）脑内递送及对原位胶质瘤的治疗效果

《International Journal of Nanomedicine》：Hybrid Liposome–U87MG Membrane Nanovesicles Enhance Brain Delivery and Therapeutic Efficacy of Irinotecan in Orthotopic Glioma

摘要 背景：血–脑屏障（BBB）及内酯形式的水解失活限制了伊立替康（CPT-11）对胶质瘤的疗效。为解决上述问题，研究人员开发了一种载CPT-11的杂合脂质体–U87MG细胞膜纳米囊泡制剂（Hybrid/CPT-11），这是一种在胶质瘤治疗中尚待深入探索的仿生策略。该制剂将脂质体（Lip）的载药与稳定化能力，与由U87MG细胞膜制备的仿生纳米囊泡（BNVs）的膜衍生功能相结合。 方法：比较了三种制备策略——共孵育、冻融后共挤出、薄膜水化后共挤出。采用荧光共振能量转移（FRET）评估膜融合，以筛选最优工艺。对理化性质（透射电镜、流体力学粒径/多分散指数、包封率、短期储存与血清稳定性）进行了表征。在原位U87MG及U87MG-Luc胶质瘤模型中，评价了体外性能（U87MG细胞摄取、三维球体穿透、增殖与迁移抑制）、体内生物分布（Cy5成像）、抗肿瘤疗效（生物发光成像、肿瘤负荷、生存期）及生物安全性（体重、血液学、主要器官组织学）。 结果：冻融后共挤出引起的FRET下降最大，被选为最优方法。Hybrid/CPT-11呈均一的纳米级粒径（178.4 ± 4.6 nm，PDI 0.22 ± 0.01）、高包封率（61.6%）及良好稳定性。体外实验中，Hybrid/Cou-6较游离Cou-6和BNV/Cou-6表现出增强的细胞摄取及更深的三维球体穿透。与游离CPT-11及非杂合对照相比，Hybrid/CPT-11在U87MG细胞中IC50最低。体内实验中，Hybrid/Cy5较Lip/Cy5和BNV/Cy5延长了全身信号持续时间并增强了脑内蓄积。在原位U87MG-Luc胶质瘤中，Hybrid/CPT-11抑制肿瘤生物发光、降低终点肿瘤负荷并延长中位生存期（21天 vs 游离CPT-11的16天），且无显著体重下降、血液学异常或主要器官病理改变。 结论：本研究开发了一种经FRET优化的杂合脂质体–U87MG细胞膜纳米囊泡制剂，可增强伊立替康的脑内递送及对原位胶质瘤的治疗效果。

一、研究背景与立项依据

胶质瘤是成人最常见的原发性恶性脑肿瘤，约占此类肿瘤的80%–85%，呈高度浸润性生长、弥漫性浸润及治疗抵抗特征。按2021年世界卫生组织（WHO）分级，高级别胶质瘤（3–4级）预后极差，即使经手术、放疗与化疗，中位生存期仍仅12–18个月，五年生存率低于5%。有效药物治疗的主要障碍是血–脑屏障（BBB），其限制大多数全身给药制剂进入脑实质，导致颅内病灶药物浓度不足。既往主动靶向策略多依赖抗体、多肽、适配体等对纳米载体的表面功能化，但体内获益有限、临床转化困难，可能与肿瘤微环境异质性、瘤内穿透不足、蛋白冠形成、免疫清除及规模化制备复杂性有关。

来源于癌细胞膜的仿生纳米囊泡（BNVs）保留了关键膜相关生物分子，可能赋予生物相容性、免疫逃逸及同型靶向潜力，但其载药与膜完整性高度依赖工艺，需在载药量与结构稳定性间权衡。脂质体（Lip）组成可调、结构稳定、包封率高，但血–脑屏障穿透有限且缺乏颅内肿瘤特异性。将二者融合的杂合纳米囊泡可整合互补优势，其价值不仅取决于两组分共存，更取决于是否实现有效而稳定的膜融合；共孵育、共挤出等常规工艺的融合效率与囊泡结构差异较大，可能影响均一性与重现性，因此对膜融合进行定量评价与系统优化十分必要。

伊立替康（CPT-11）为喜树碱衍生的拓扑异构酶I抑制剂，作用机制不同于一线药物替莫唑胺（TMZ），可避免交叉耐药，常与贝伐珠单抗联用。但其胶质瘤应用受两方面限制：血–脑屏障通透性受限；在生理或弱碱性条件下活性内酯环易水解为无活性羧酸盐形式，疗效明显降低。因此需要一种既能提高颅内肿瘤暴露、又能在循环中维持CPT-11活性内酯构型的递送系统。基于此，研究人员开发了载CPT-11的杂合脂质体–U87MG细胞膜纳米囊泡制剂（Hybrid/CPT-11），据其所知，这是首批用于CPT-11递送的脂质体–细胞膜杂合纳米囊泡之一；研究重点在于优化膜融合过程而非单纯表面功能化，系统比较三种杂合工艺，并以荧光共振能量转移（FRET）定量评估与优化合成–生物界面的融合效率。

二、主要关键技术方法

研究采用薄膜水化结合跨膜硫酸铵梯度主动载药制备Lip/CPT-11；以系列孔径聚碳酸酯膜挤出U87MG细胞制备BNVs并按同样梯度策略载药；比较共孵育、冻融后共挤出、薄膜水化后共挤出三种杂合工艺，以FRET（NBD-PE/Rhod-PE标记）筛选最优方法；通过透射电镜（TEM）、动态光散射（DLS）、超滤离心法表征粒径、多分散指数（PDI）与包封率（EE），并评价4 °C储存与含血清稳定性；体外采用CCK-8、划痕愈合、激光共聚焦与流式细胞术、三维肿瘤球体模型；体内采用立体定位颅内接种U87MG及U87MG-Luc细胞建立原位胶质瘤模型（BALB/c裸鼠，6–8周龄，购自Spiffy（北京）生物技术有限公司），行Cy5全身及离体荧光成像、生物发光成像（BLI）、生存分析、血液学与主要器官苏木精–伊红（H&E）染色。

三、研究结果

Hybrid/CPT-11的制备与表征：TEM显示Lip/CPT-11为球形颗粒，BNV/CPT-11呈典型囊泡样结构，Hybrid/CPT-11呈多腔室囊泡形态、膜厚度不均，符合杂合后囊泡重构特征。DLS显示三者粒径分别为156.27 ± 0.95 nm（PDI = 0.20 ± 0.01）、449.57 ± 11.51 nm（PDI = 0.50 ± 0.098）、178.43 ± 4.63 nm（PDI = 0.22 ± 0.01），杂合制剂较小且更均一。包封率分别为69.23%、38.7%、61.64%，杂合制剂高于BNV/CPT-11而与Lip/CPT-11相当。4 °C储存7天粒径与PDI无显著变化（P > 0.05），10%胎牛血清（FBS）孵育60 min亦无显著改变。FRET效率：脂质体63.70%，Hybrid-M1为63.27%，Hybrid-M2为45.41%，Hybrid-M3为60.50%，Hybrid-M2降幅最大，被选为最优工艺。

U87MG细胞摄取与三维肿瘤球体穿透：共聚焦显示2 h至4 h细胞内荧光随时间增强，Lip/Cou-6与Hybrid/Cou-6信号强于游离Cou-6和BNV/Cou-6；流式细胞术显示平均荧光强度（MFI）随Cou-6浓度升高而增加，脂质体与杂合组最高、直方图右移。三维球体（约300–400 μm）孵育2 h后，各制剂组球体内分布优于游离Cou-6，Lip/Cou-6与Hybrid/Cou-6荧光更深更明显。

体外抗肿瘤活性与三维球体生长抑制：各载药制剂均呈浓度依赖性抑制细胞活力，Hybrid/CPT-11的IC₅₀最低（13.55 μg/mL），低于游离CPT-11（21.29 μg/mL）、BNV/CPT-11（16.18 μg/mL）与Lip/CPT-11（15.19 μg/mL）。划痕试验中各组相对迁移率下降，Lip/CPT-11与Hybrid/CPT-11呈更强抑制趋势，但10 μg/mL CPT-11的抗增殖作用亦可能参与其中。8天三维球体培养中，各载药制剂抑制生长均优于游离CPT-11，Hybrid/CPT-11与Lip/CPT-11组球体体积持续小于BNV/CPT-11与游离药物组。

原位胶质瘤小鼠体内生物分布与脑内蓄积：全身荧光成像显示游离Cy5信号迅速衰减，而Cy5标记制剂尤其Hybrid/Cy5信号持续至12 h。12 h离体器官成像显示制剂主要蓄积于肝、脾、肾；脑内蓄积差异显著，游离Cy5脑内荧光极少，Hybrid/Cy5脑组织荧光最强，优于Lip/Cy5与BNV/Cy5。

原位U87MG-Luc胶质瘤模型体内抗肿瘤疗效：对照组与游离CPT-11组生物发光迅速增强，载药制剂组信号受抑；第20天对照组与BNV/CPT-11组因小鼠死亡或濒死无法成像。Hybrid/CPT-11对肿瘤生物发光的抑制更持久，离体脑组织肿瘤明显更小、更局限。Kaplan–Meier分析显示对照组、游离CPT-11、Lip/CPT-11、BNV/CPT-11与Hybrid/CPT-11组中位生存期分别为16、16、18、20、21天，杂合制剂延长最显著；H&E染色显示其肿瘤浸润最少、病理改变最轻。

Hybrid/CPT-11体内安全性评价：各组体重随时间总体下降，对照组下降更明显，Hybrid/CPT-11组下降相对较小。终点血液学指标（红细胞计数、白细胞计数、血红蛋白、血小板计数）组间无统计学差异，杂合制剂组维持在正常生理范围。主要器官H&E染色未见明显炎症、坏死或细胞凋亡等病理损伤；各组均见轻度心肌纤维疏松，以对照组最明显，可能与该原位模型本身及全身负荷有关，而非治疗相关心脏毒性。

四、讨论与结论

讨论指出，CPT-11临床应用受内酯环生理条件下开环及血–脑屏障限制；脂质体可改善药代动力学并保护CPT-11免于过早失活，但颅内特异性有限；细胞膜基纳米载体可改善肿瘤靶向。Hybrid/CPT-11保持较高包封率（61.64%），主要归因于跨膜硫酸铵梯度（pH 6.4）形成的囊内酸性环境，通过离子化截留药物并在理论上稳定活性内酯形式。FRET作为“分子尺”验证了膜融合：冻融循环可扰动膜完整性并促进囊泡间融合/重塑，后续挤出改善粒径分布，杂合制剂约178 nm、PDI 0.22、血清中稳定，支持制备过程中发生脂质混合。细胞摄取与三维球体穿透结果表明膜基纳米系统在扩散受限条件下具优势；杂合制剂二维摄取与Lip/Cou-6相当或略低，但IC₅₀更低、长期三维培养抑制更强，提示其优势不仅在于递送量，还可能与内体/溶酶体转运加工、胞内滞留及释放动力学等内化后过程有关；由于Cou-6仅为替代荧光探针，其分布未必完全反映药物载荷，相关机制尚需亚细胞共定位与胞内药物定量验证。体内实验中Hybrid/Cy5脑组织荧光更强且信号持久，可能源于脂质组分调节亲水性以延长循环、仿生膜蛋白参与血–脑屏障转运；Hybrid/CPT-11抑瘤最显著、中位生存期最长（21天），可能与脂质体高载药能力与BNVs靶向能力的协同提高局部药物浓度有关，杂合系统的缓释特性与稳定性亦可能延长CPT-11作用时间。生物安全性方面未见明显体重下降或血液学异常，轻度心肌纤维疏松各组均存在，提示与模型本身相关。

作者同时指出局限：摄取与分布采用Cou-6、Cy5荧光示踪，不能建立CPT-11药代动力学或实际组织药物暴露，未测定血浆、脑与肿瘤组织中CPT-11及SN-38浓度及内酯/羧酸盐比值，后续将以液相色谱–串联质谱（LC-MS/MS）多时间点定量并测定该比值；缺乏血–脑屏障转运与同型识别的直接机制证据，后续将行膜蛋白质组学分析并以蛋白特异性阻断或基因敲除（如基于hCMEC/D3细胞的体外血–脑屏障模型）验证；U87MG原位模型对临床胶质瘤异质性与微环境的代表性有限，需在患者来源异种移植（PDX）等更接近临床的模型中确认疗效与重现性；体外与体内实验缺少空白Lip、BNV及Hybrid对照组，限制了对非CPT-11载体效应的评估；FRET仅支持脂质混合，未直接证实单个囊泡内脂质体与BNV膜组分的共定位；缺少物理混合物对照，难以判断疗效是否特异于杂合制剂；稳定性评价仅限7天储存与短期血清暴露，长期稳定性与规模化批间一致性尚待评估。

结论：本研究通过将脂质体与U87MG细胞膜来源BNVs整合，开发了经FRET优化的载CPT-11杂合脂质体–U87MG细胞膜纳米囊泡制剂（Hybrid/CPT-11）。冻融共挤出法实现了高效杂合，为改善常规制剂脑内递送受限提供了合理策略。该制剂结合脂质体的高包封率与U87MG细胞膜BNVs的膜衍生功能，提高了细胞摄取、三维球体穿透、脑内蓄积及原位胶质瘤模型中的抗肿瘤疗效，并显示可接受的初步生物相容性。上述结果支持杂合纳米囊泡作为胶质瘤药物递送的有前景仿生平台，并为进一步的机制、药代动力学与转化研究提供了临床前基础。