长散在核元件-1（LINE-1）逆转录转座子是通过"复制-粘贴"机制移动其位置的移动遗传元件。LINE-1的移动由ORF2p催化，ORF2p是一种多功能酶，协调复杂的反应，将LINE-1 mRNA逆转录并整合至基因组中。自发现LINE-1在近四十年前仍具有活性以来，大量细胞、基因组和生物化学研究揭示了人类LINE-1生物学的显著复杂性。然而，仅在过去五年中，ORF2p复合物的结构才开始阐明其功能背后的分子机制。本文综述了ORF2p在结构和机制理解方面的最新进展，并强调了新的结构见解如何重塑了LINE-1逆转录转座的模型。最后，研究人员探讨了未来的结构研究如何进一步阐明这一非凡逆转录转座子的机制。
1. 引言
转座元件是可在宿主基因组内通过从一个基因组位置移动到或"跳跃"到另一个位置来增加其拷贝数的重复遗传序列。得益于现代测序工作，现已知道转座元件构成许多真核基因组的相当大一部分，并且几乎存在于所有生物体中[1]，仅有少数已知例外[2]。这些元件通过多种机制动员[3,4]，使其能够插入新的基因组位置并在进化过程中重塑基因组架构。尽管人类基因组包含许多类别的转座元件及其残余[5]，但只有长散在核元件1（LINE-1）逆转录转座子仍能自主动员并产生新的插入[6,7,8,9]。
LINE-1的发现始于20世纪60年代的研究，这些研究确立了哺乳动物基因组含有大量重复DNA序列[10,11]。后续工作表明LINE-1占人类基因组的很大比例[12,13]，它被活跃转录[14,15,16]，且LINE-1编码的ORF与病毒逆转录酶具有同源性[17]。这后一项研究为LINE-1在进化过程中的优先扩散提供了合理解释；即编码蛋白可能结合其自身的信使RNA（mRNA）并通过逆转录将其整合回基因组。LINE-1在人类中仍可移动的确切证据来自1988年，当时在两个无关患者的因子VIII基因中鉴定到de novo LINE-1插入，被确定为A型血友病的病因[18]。此后，大量研究详细描述了LINE-1生物学的各个方面，包括逆转录转座机制[19,20,21]、细胞通路对其的调控[22,23,24]、对基因组进化的影响[20,25,26]以及对正常和疾病人类生理学的后果[27,28,29,30]。
虽然先前的结构工作已对某些LINE-1蛋白或其分离结构域提供了重要见解[31,32,33]，但过去五年中出现了若干里程碑式的论文，捕获了边界非长末端重复（non-LTR）逆转录转座子机器的结构[34,35]，最引人注目的是人类LINE-1 ORF2p[36,37,38,39]。由于这些重大发现已在本期及其他地方进行了综述[40]，本综述仅聚焦于目前对LINE-1生物学的分子理解的最新进展，并以前瞻性视角进行讨论。
2. LINE-1如何在基因组中移动
现在认识到LINE-1通过RNA中间体动员，逆转录转座始于从元件5′非翻译区内含启动子转录LINE-1 mRNA（图1）。输出到细胞质后，LINE-1 mRNA被翻译产生逆转录转座所需的两种蛋白：开放阅读框1蛋白（ORF1p）和开放阅读框2蛋白（ORF2p）。ORF1p是一种三聚体核酸结合蛋白，与病毒核蛋白具有结构和功能相似性[32,41,42,43]，而ORF2p同时具有核酸内切酶和逆转录酶活性[44,45]。
在翻译过程中，ORF1p和ORF2p均优先与其转录本结合，形成能够进行逆转录转座的核糖核蛋白（RNP）（图1，顺式偏好与LINE-1核糖核蛋白）[46,47,48]。LINE-1蛋白机器与其编码mRNA的这种优先结合被称为顺式偏好（cis-preference），有利于功能性LINE-1元件而非其他RNA序列的传播。然而，这种偏好并非绝对的，因为LINE-1可以通过反式方式动员其他RNA，包括非自主逆转录转座子（Alu和SVA）或加工过的mRNA[49]。特别是Alu元件在克服LINE-1顺式偏好并劫持其机器进行动员方面非常成功，导致人类基因组中存在超过110万个Alu拷贝[5]。LINE-1 RNP必须进入细胞核内的DNA才能进行逆转录转座。目前证据表明核进入通过多种机制实现。研究表明进入受细胞分裂期间核膜破裂的门控[50]，且与染色体DNA的结合依赖于RNP凝聚和复合物内ORF1p的浓度[51]。然而，已证明逆转录转座可在G1/S期阻滞的人类胶质瘤细胞系中发生，尽管水平低于分裂细胞[52]，且对核输入因子转运蛋白1的调控敏感[53]，表明LINE-1 RNP可在细胞未活跃进行有丝分裂时通过核孔进入细胞核。
一旦建立对DNA的访问，逆转录转座通过"复制-粘贴"机制进行。在高层次上，该过程涉及通过两个连续的切口和DNA合成反应将LINE-1 mRNA逆转录回基因组：底链切口，随后是第一链cDNA合成；以及顶链切口，随后是第二链DNA合成。在该模型中，ORF2p的核酸内切酶（EN）结构域首先在共有序列（3′-AA|TTTT-5′）处切割基因组靶DNA的底链（图1，步骤1）。暴露的3′端引发mRNA的逆转录（图1，步骤2）。该机制称为靶向引物逆转录（TPRT）[54]，产生第一cDNA链。ORF2p切割靶DNA顶链随后进行第二链DNA合成，导致逆转录转座子的新基因组插入（图1，步骤3和4）。一些研究还提出，细胞核酸酶或复制中间体而非ORF2p可能参与顶链切割和第二链合成的启动[37]。
3. 靶向引物逆转录过程中捕获的ORF2p结构
似乎所有非LTR逆转录转座子都通过TPRT机制传播[55]。尽管大量研究详细描述了ORF2p的生化活性[44,45,56,57,58]，包括核酸内切酶和逆转录酶活性，但早期对LINE-1 TPRT的大部分机制理解是从家蚕R2元件的开创性研究中推断的[54]。R2选择性插入28S核糖体RNA基因，并作为非LTR逆转录转座机制的生化模型，包括对LINE-1的研究。后续研究首次提供了LINE-1使用相同TPRT机制的证据[56]。然而，直到最近，TPRT的直接生化观察和LINE-1活性的结构基础在很大程度上仍然难以捉摸。两个新结构展示了组装的ORF2p与DNA:RNA异源双链的复合物，以模拟cDNA合成的中间体[36,37]。这些研究揭示了ORF2p的整体架构及其活性位点内核酸相互作用的分子细节。
从在双链DNA底物上TPRT过程中捕获的ORF2p冷冻电镜（cryo-EM）结构中获得了进一步信息[38]。在生化TPRT分析的指导下，ORF2p纯化和核酸底物设计均被优化以最大化活性。最显著的改进来自靶DNA的设计。靶DNA来源于首次确立LINE-1在人类中活性的因子VIII de novo插入位点[18]。完全完整的双链靶DNA几乎检测不到TPRT活性，而预切割同一底物的底链则显著增加活性。这种预切割底物模拟底链切割后形成的中间体（图1，步骤1），可能绕过了TPRT复合物组装中的调控步骤。优化靶DNA底物的插入共有基序延长了T串并适度刺激了TPRT活性，这符合逆转录起始的"snap-velcro"模型的预测[59,60]。将这些优化组分与链终止核苷酸类似物结合，使ORF2p停滞在TPRT起始阶段，从而允许捕获TPRT复合物进行结构分析。
与其之前的ORF2p结构一样，TPRT复合物的结构揭示了篮状架构，其中ORF2p的六个主要结构域——N端核酸内切酶（EN）、连接子、N端延伸（NTE）、逆转录酶（RT）和拇指结构域、腕部以及C端片段（CTD）——围绕部分与RNA杂交的DNA靶标组织（图2a）。然而，与先前结构不同的是，TPRT结构揭示靶DNA被分成两个空间上分离的部分，表明ORF2p广泛重塑DNA底物以进行TPRT。这两个区域称为第一和第二引物区域，在复合物中遵循不同的路径。第一引物区域位于RT活性位点内，与模板RNA杂交并定位以支持第一链合成（图1，步骤2）。
相比之下，第二引物区域沿ORF2p外部延伸，穿过CTD向RT活性位点行进。CTD解链靶DNA的这一区域，暴露顶链中可能引发第二链合成的序列（图1，步骤4）。观察到靶DNA的两个分离区域是出乎意料的，因为物理上将DNA分离为两个片段的顶链切割被认为仅在第一链合成完成后才发生，如R2元件所示[61]。然而，结构和生化数据均表明顶链切割可在第一链合成之前或期间发生。目前尚不清楚该机制相对于调控性顶链切割有何优势。
顶链切割对EN共有切割基序的偏好较弱，与底链切割不同[44,62]。EN结构域的特异性似乎反映了DNA序列、构象和架构之间的相互作用[33,39,63]。在底链切割过程中，对3′-AA|TTTT-5′序列的更强偏好可能被强制执行以促进切口DNA链与mRNA poly(A)尾的退火，这对启动第一链合成至关重要。顶链切割过程中序列要求可能放宽，允许DNA架构和偏好对切割位点选择施加更大影响。这种转变将允许EN结构域采样更广泛的切割位点以引发第二链合成。
在某些细胞类型中，5′-截短的LINE-1插入在多达95%的插入事件中被观察到[64]，但截短机制尚不清楚。同时发生的顶链切割和第一链合成可能解释5′-截短LINE-1插入的普遍性，即第二链合成在第一链cDNA合成完成之前利用切口的顶链启动。其他非互斥的5′-截短插入机制也有记载，包括抗病毒防御系统对LINE-1 mRNA的切割，或在完全合成之前将TPRT产物与基因组插入位点连接的DNA修复末端连接途径[65]。
EN结构域的密度在共有TPRT冷冻电镜重建中缺失，表明其灵活地附着于复合物。然而，迭代的聚焦分类和局部精修在一部分颗粒中解析了EN结构域以针对连接子结构域定位（图2b）。尽管这种灵活性未被预期，但与观察到的靶DNA解链一起，为LINE-1插入特有的可变靶位点重复（TSD）长度提供了令人满意的解释。TSD源于顶链和底链DNA的错位切割，在LINE-1插入中长度可变，但通常范围为7至20 bp[66,67]。将切口DNA底物建模到重建中，将EN结构域定位在距底链切口约20 nt处（图2b）。该构型可能代表顶链切割构象，因此将设定TSD长度的上限。ORF2p介导的第二引物区域解链将使底链切口向EN结构域靠近，缩短顶链和底链切割位点之间的距离（图2c）。这将导致较短的TSD，并解释了观察范围的下限。
4. 与宿主复制机器的相互作用
虽然该结构为TPRT机制提供了关键见解，但LINE-1插入的几个基本方面仍不清楚。分析表明，在TPRT复合物结构中，ORF2p主要通过非序列特异性相互作用与核酸结合[38]，提出了该酶如何选择其mRNA poly(A)尾或定位基因组中合适靶位点的问题。此外，尚不清楚为何ORF2p不能有效切割完全双链靶DNA的底链，这是启动TPRT的必要步骤。这些观察表明ORF2p可能依赖宿主因子在逆转录转座反应的一个或多个步骤中促进核酸结合。
AlphaFold预测的ORF2p与参与LINE-1逆转录转座的宿主因子之间的相互作用[68,69]鉴定出若干显著复合物，包括ORF2p与增殖细胞核抗原（PCNA）之间的复合物（图3a）。PCNA先前被提出通过NTE中的经典PCNA相互作用蛋白（PIP）盒（残基407至415）与ORF2p相互作用[68]。PIP盒是存在于众多蛋白质中的保守基序，包括复制性DNA聚合酶，使其能够结合PCNA[70,71]。然而，AlphaFold预测表明PCNA通过ORF2p腕部结构域中先前未被识别的位点结合，研究人员将其命名为PCNA非寻常结合（PUB）基序（图3a）。该预测得到汇聚证据的支持：PCNA以与冷冻电镜结构中观察到的靶DNA兼容的方向加载到DNA上；PUB基序内的丙氨酸替换严重损害体内逆转录转座[72]；该区域的点突变破坏了体外PCNA结合[38]；与PCNA接触的PUB基序残基在不同物种的LINE-1元件中保守[38]。
尽管有证据表明PCNA参与逆转录转座，但其确切作用仍不清楚。PCNA作为复制性DNA聚合酶的关键持续合成因子发挥作用[73]，然而ORF2p本身似乎具有高度持续合成能力[36,37]。一些数据表明PCNA可能在靶DNA切割和cDNA合成期间或之后被招募[68]，可能有助于从第一链向第二链合成的过渡。或者，PCNA可能帮助将ORF2p定位到允许底链切割的靶DNA架构。在体外，ORF2p底链切割被部分双链DNA底物强烈刺激，这些底物类似于PCNA在复制过程中加载的DNA结构，包括引物-模板连接和带缺口DNA[37,39,63]。
PCNA与ORF2p PUB基序之间的相互作用比经典PIP盒形成的相互作用更为广泛（图3b），这可能使ORF2p能够与宿主因子竞争PCNA的访问，例如与Pol ε或Pol δ竞争（图3c，步骤1）。通过这种相互作用，ORF2p可被招募到单链/双链DNA连接处启动逆转录转座，而无需序列特异性相互作用或广泛基因组扫描（图3c，步骤2）。尽管该模型具有吸引力，但需要进一步研究来确定这些部分双链DNA底物是否代表ORF2p的真实生理靶标，或者它们是否仅仅绕过了启动的正常要求，如在其他体外核蛋白系统中观察到的那样[74,75]。从近期结构推断生理靶标是困难的，因为每项研究使用的组装策略绕过了启动的某些方面[36,37,38,39]，对TPRT最早阶段提供的见解有限。尽管这些结构并非旨在定义生理靶标，但ORF2p在所有这些人底物上的相似架构表明ORF2p能够容纳多样的核酸。这进一步复杂化了仅从结构数据确定生理靶标的过程。未来捕获初始靶DNA结合和底链切割的生化和结构研究将需要确立当前结构与生理TPRT启动的关系。
5. 与宿主胞质因子在翻译和mRNA稳定性中的相互作用
除PCNA外，胞质多聚腺苷酸结合蛋白1（PABPC1）作为与ORF2p相互作用的高置信度预测脱颖而出。这立即提示了与LINE-1 RNP生物发生的潜在联系[38,77]。PABPC1是结合胞质mRNA poly(A)尾并调控其稳定性的主要蛋白[78]。PABPC1在天然纯化后也与LINE-1 RNP相关联[68,69]，而据报道PABPC1的敲低在基于细胞的实验中降低逆转录转座活性和RNP稳定性[77]。AlphaFold预测PABPC1的N端RNA识别基序与ORF2p连接子结构域中的长螺旋相互作用（图4a）。与此一致，预测相互作用界面处的突变破坏了人类细胞中PABPC1-ORF2p的共定位[38]并降低了逆转录转座活性[72]。PABPC1似乎是LINE-1 RNP内ORF2p与mRNA相互作用的重要介质，因为其在复合物中的定位可能有助于将RNA朝向ORF2p RT活性位点定向（图4a）。PABPC1沿poly(A)尾的多聚化将把ORF2p结合限制在最3′端的RRM1结构域，有效地将ORF2p定位在mRNA poly(A)尾的3′端。这种定位可能保护LINE-1 mRNA免受去腺苷酸化途径的影响并保持长poly(A) tract，这一特征与逆转录转座潜力相吻合[79,80]。ORF2p在poly(A)尾3′端的定位也可能限制尿苷化，这是LINE-1 mRNA的常见修饰[81,82]。这可能有助于维持RNA与靶DNA引物之间的互补性，这是影响逆转录起始效率的一个方面[59]。
顺式偏好引导ORF2p优先与其自身编码mRNA结合[83,84]，并确保逆转录转座机器作用于功能性LINE-1 mRNA而非截短的LINE-1转录本[83]。LINE-1移动性对其mRNA poly(A)尾具有独特依赖性，而非依赖于3′ UTR内的序列或结构元件[80]。最强证据来自一项研究，该研究工程化LINE-1 mRNA通过用抗降解RNA结构替换poly(A)尾来绕过多聚腺苷酸化[80]。这些构建体的逆转录转座活性几乎完全丧失， co-免疫沉淀表明ORF2p与mRNA的结合也减少。在这些构建体中RNA结构下游添加最小poly(A)尾恢复了逆转录转座活性。
PABPC1与ORF2p之间的直接相互作用为顺式偏好如何建立提供了分子解释。PABPC1与新生ORF2p的分子内结合将在共翻译过程中建立顺式偏好，并可能通过将模板RNA定位以与ORF2p折叠来促进RNP形成（图4b）。该机制似乎比ORF2p直接碱基特异性识别poly(A)尾更合理，因为持续的碱基特异性相互作用可能干扰cDNA合成过程中模板RNA通过ORF2p RT活性位点的持续移动。poly(A)尾几乎是mRNA的普遍特征，这可能解释为何细胞mRNA偶尔被视为"逆转录转座"的加工假基因[49]。
更广泛地说，ORF2p对其编码mRNA poly(A)尾的依赖性可能是非自主逆转录转座子劫持ORF2p进行自身移动所利用的脆弱性[83]，最显著的是Alu元件。Alu元件不编码自身的逆转录转座因子，但它们是人类基因组中所有移动元件中最丰富的[5]。这种成功可能在于其打破LINE-1顺式偏好的非凡能力。Alu形成高度结构化的二聚体RNP，每个二聚体祖先来源于信号识别颗粒（SRP）7SL RNA的Alu结构域[85]。SRP由两个结构域组成，Alu结构域和S结构域，识别翻译核糖体以指导膜蛋白合成到内质网[86]。使SRP能够接合核糖体的特征存在于Alu RNP中，对Alu逆转录转座至关重要。SRP9/14异二聚体与Alu RNA的结合似乎是逆转录转座所必需的[87,88]。将最小Alu RNP结构替代SRP对接在翻译核糖体上进一步表明它与两个核糖体亚基形成多重接触，使其能够占据核糖体延伸因子结合位点[89]。
因此，Alu打破顺式偏好的工作模型是它通过SRP9/14被招募到翻译LINE-1 mRNA的核糖体上（图4c）。在核糖体上，Alu RNP的poly(A)尾可与LINE-1 mRNA竞争ORF2p结合。预测的ORF2p-PABPC1复合物表明PABPC1可能参与该过程，尽管PABPC1在建立或打破顺式偏好中的作用目前尚不清楚。
6. 未来展望
虽然ORF2p EN结构域[31,33]和RT催化核心[36]的早期晶体结构对理解这些结构域的功能至关重要，但全长ORF2p复合物的冷冻电镜结构提供了关键的机制进展，并为LINE-1逆转录转座机制的其他领域提供了信息[37,38,39]。预期未来工作将聚焦于ORF2p与其相互作用伙伴如PCNA和PABPC1的复合物结构，或逆转录转座其他阶段如第二链合成的结构。冷冻电镜"分辨率革命"以来的十年见证了冷冻电镜在广泛目标上的扩展应用[90]。已出现众多技术和方法学进展以促进困难样品如ORF2p的结构测定。本文强调几种可能有益于含ORF2p复合物研究的方法。
网格支撑膜，特别是氧化石墨烯，已被非常有效地用于解决当前纯化方法可获得的活性ORF2p量有限的问题。尽管进行了大量样品和网格冷冻优化，研究人员仍遇到该问题。使用这些支撑膜非常适合其他丰度低的目标，如可能需要内源性纯化的脆弱复合物[91]。解决优选取向问题的新方法包括将样品快速喷洒到网格上以防止与空气-水界面（AWI）的优先结合[92]，以及LEA蛋白——粘附于AWI以将目标蛋白排除在该区域外的肽[93]。异质样品的处理算法已使从混合群体中确定多个结构成为可能，这可能与采用多种构象的复合物相关[94,95]。值得注意的是，尽管在TPRT复合物研究中解析了EN的一种构象，但数据表明样品中存在其他构象。最后，冷冻电子断层扫描的使用近年来有所扩展，子断层平均可用于研究定位并确定ORF2p和LINE-1 RNP在其天然背景中或细胞周期不同阶段的结构[96,97]。
预期这些技术的使用将有助于解决围绕ORF2p与细胞复制机器之间相互作用的开放问题。目前，LINE-1插入的生理DNA底物仍不清楚；尽管近期研究利用了包括切口、悬垂和张开末端的合成DNA底物，但尚不清楚这些构建体是否代表真正的插入靶位点。鉴定TPRT的真实底物将有助于阐明该过程是否通过复制中间体发生。它还将促进解决DNA复制相关蛋白如何介导逆转录转座的研究。尽管预测ORF2p与PCNA相互作用，但目前尚不清楚ORF2p如何定位到复制泡并与DNA聚合酶竞争PCNA的访问，或者在缺乏复制体的情况下是否存在ORF2p访问PCNA的替代机制。研究还表明ORF2p与构成部分CMG解旋酶的MCM蛋白相关联[50,69]，表明ORF2p可能接合多个复制因子以定位合适的插入底物。由PARP2招募到LINE-1整合位点的RPA可保护ssDNA TPRT中间体[98]，并可能因此协助第二链合成。ORF2p与这些因子复合物的结构研究将提供DNA靶位点如何选择以及新LINE-1插入如何发生的机制细节。
围绕顺式偏好还有几个开放问题。新合成的ORF2p如何访问其正在翻译的mRNA的poly(A)尾而非反式中的另一mRNA，目前尚不清楚。该过程可能纯粹通过空间位阻调控，或者PABPC1可能参与在翻译过程中将新生链捕获在mRNA上。预期LINE-1 mRNA活跃翻译期间核糖体的结构将阐明顺式偏好如何实现。Alu的研究将有助于理解顺式偏好随后如何被打破。Alu RNP被招募到翻译LINE-1 RNA的核糖体的机制是一个特别令人感兴趣的领域。ORF2p不携带信号序列且Alu RNP没有S结构域，因此Alu如何被选择性招募到翻译LINE-1的核糖体上并不明显。可能存在促进该过程的未知因子。生化和结构方法可能使分离翻译LINE-1 mRNA的核糖体并鉴定辅助宿主因子成为可能。该领域的未来工作将有益于对Alu逆转录转座的理解，并可能揭示通过破坏顺式偏好在疾病背景下抑制LINE-1的策略。
7. 结论
LINE-1可以说是人类中最具影响力的移动元件。它在进化过程中塑造了我们的基因组，并持续影响当今的人类生物学[27,29]。LINE-1生物化学和结构生物学的进展已开启了一个新时代，整个逆转录转座途径的分子原理可以以前所未有的细节被揭示。ORF2p的结构以及日益复杂的复合物如LINE-1 RNP，为未来合理设计抑制疾病中LINE-1活性的疗法或将 these 分子"复制-粘贴"机器重新利用为生物技术新工具的努力带来了希望。
