紫花苜蓿越冬期根系生理指标与代谢物的关联分析

《Biology》：Correlation Analysis of Root Physiological Indicators and Metabolites of Medicago sativa During Overwintering Period

　　

紫花苜蓿（Medicago sativa）是一种高产高蛋白的饲草作物，在全球范围内种植面积最大。然而，冬季冻害严重限制了其在中国东北高纬度地区的生长，尤其是影响作为抗寒关键功能组织的根系。迄今为止，低温条件下紫花苜蓿根系的生理特征和代谢响应仍不清楚。本研究在越冬期间比较了耐寒品种‘龙牧801号’（Longmu801）和冷敏感品种‘萨迪’（Sardi）的根系。研究人员测量了根系生理指标，并进行了代谢组学分析。结果表明，‘龙牧801号’根系中谷胱甘肽（GSH）、蔗糖（SUC）、可溶性糖（SS）和脯氨酸（Pro）的含量显著高于‘萨迪’，而过氧化物酶（POD）和超氧化物歧化酶（SOD）活性以及H2O2和丙二醛（MDA）含量则显著较低（p < 0.05）。代谢组学分析鉴定出304种差异积累代谢物（DAMs）。DAMs与生理指标的关联分析显示，MEblue模块中的DAMs与谷胱甘肽、脯氨酸和可溶性糖呈显著正相关（p < 0.05）。这些DAMs主要富集于精氨酸和脯氨酸代谢、谷胱甘肽代谢、三羧酸循环和丙酮酸代谢等通路。进一步鉴定出四种与耐寒性相关的候选DAMs，即亚精胺、N-乙酰-L-谷氨酸-5-半醛、柠檬酸和苹果酸。这些发现为培育耐寒紫花苜蓿品种以及改善高纬度寒冷地区越冬生产提供了理论依据和候选代谢标记物。

研究背景与科学问题

紫花苜蓿（Medicago sativa）是全球种植最广、经济价值最高的豆科饲草作物。然而，低温胁迫是限制温带作物产量的主要非生物因素之一，每年约造成40%的生产损失。近年来全球气候灾害频发，极端寒冬事件增多，使植被面临更高的冻害风险。在中国黑龙江省等高纬度地区，冬季极端低温极易导致紫花苜蓿根系发生冻害，这已成为制约当地苜蓿产业发展的重大技术瓶颈。尽管从美国、加拿大等国引进了多个品种，但许多品种无法适应当地严酷的冬季条件，导致越冬存活率降低和产量损失。根系是紫花苜蓿抵御冬季严寒的关键功能器官，其养分储存能力与植物的耐寒性、产量和品质密切相关。目前，越冬期紫花苜蓿根系中生理指标与代谢物之间的关系尚不明确。因此，本研究旨在整合生理指标与差异代谢物图谱，阐明低温胁迫下紫花苜蓿根系的生理和代谢响应，为高纬度农业生态系统中耐寒苜蓿的遗传改良提供理论基础。

研究设计与主要结论

研究人员以耐寒品种‘龙牧801号’（Longmu801，秋眠级1级）和冷敏感品种‘萨迪’（Sardi，秋眠级7级）为材料，在黑龙江省齐齐哈尔市自然田间条件下进行盆栽试验。设置了花期对照组（CK）和越冬期组（YD），分别于2025年6月20日（花期）和2025年12月20日（越冬期）采集根系样品进行生理指标测定和代谢组学分析。研究发现，越冬期间‘龙牧801号’根系表现出更优的生理性能：其谷胱甘肽（GSH）、可溶性糖（SS）、脯氨酸（Pro）和蔗糖（SUC）含量均显著高于‘萨迪’，而过氧化物酶（POD）和超氧化物歧化酶（SOD）活性以及H₂O₂、O₂^•-和丙二醛（MDA）含量则显著低于‘萨迪’。这表明耐寒品种维持了更好的渗透平衡、更强的非酶抗氧化能力和更低的氧化损伤水平。代谢组学分析共鉴定出304种差异积累代谢物（DAMs）。通过加权基因共表达网络分析（WGCNA），研究人员将DAMs划分为六个模块，其中MEblue模块与GSH、Pro和SS呈显著正相关。该模块的DAMs主要富集于精氨酸和脯氨酸代谢、谷胱甘肽代谢、三羧酸循环和丙酮酸代谢等通路。最终，研究人员筛选出四种与耐寒性密切相关的候选代谢物：亚精胺（spermidine）、N-乙酰-L-谷氨酸-5-半醛（NAGSA）、柠檬酸（citric acid）和苹果酸（malic acid）。这些发现为培育耐寒紫花苜蓿品种提供了候选代谢标记物和理论依据。

主要关键技术方法

1. 1.
   生理指标测定：采用硝基蓝四氮唑（NBT）光化学还原法测定超氧化物歧化酶（SOD）活性；愈创木酚氧化法测定过氧化物酶（POD）活性；蒽酮比色法测定可溶性糖（SS）含量；酸性茚三酮法测定脯氨酸（Pro）含量；5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸)（DTNB）法测定谷胱甘肽（GSH）含量；硫代巴比妥酸（TBA）法测定丙二醛（MDA）含量；间苯二酚法测定蔗糖（SUC）含量；二甲酚橙法测定H₂O₂含量；NBT还原法测定O₂^•-含量。
2. 2.
   代谢组学分析：利用超高效液相色谱-傅里叶变换质谱联用系统（UHPLC-Q Exactive HF-X）对根系组织提取物进行非靶向代谢组学分析。数据经Progenesis QI v3.0软件处理，通过与HMDB、METLIN及Majorbio内部数据库比对进行代谢物鉴定。差异代谢物筛选标准为变量投影重要性（VIP）> 1.0、倍数变化（FC）> 1.2或FC < 0.83且p < 0.05。
3. 3.
   数据分析与网络构建：采用主成分分析（PCA）和正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）进行多变量统计分析。利用京都基因与基因组百科全书（KEGG）数据库进行通路富集分析。运用加权基因共表达网络分析（WGCNA）构建代谢物共表达模块，并与生理指标进行相关性分析。

研究结果

3.1 生理指标

越冬期间，‘龙牧801号’根系中POD、SOD、H₂O₂、O₂^•-和MDA含量分别比‘萨迪’低1.03、1.17、1.21、1.19和1.07倍；而GSH、SS和Pro含量分别高出1.15、1.19和1.09倍；SUC含量也显著高于‘萨迪’。这表明耐寒品种通过积累更多渗透调节物质和非酶抗氧化剂，同时降低了氧化损伤水平。

3.2 代谢组学数据的组装与分类

主成分分析（PCA）显示，花期和越冬期样品沿PC1轴明显分离，表明两个采样期的整体代谢谱存在差异。越冬期‘龙牧801号’与‘萨迪’样品沿PC2轴分离。在YD_Longmu801 vs. YD_Sardi比较组中鉴定出304种DAMs。

3.3 DAMs的功能注释

基于OPLS-DA分析，在YD_Longmu801 vs. YD_Sardi组中鉴定出297种DAMs，其中105种上调，192种下调。KEGG富集分析显示，该组DAMs主要富集于辅因子生物合成、各种植物次生代谢产物的生物合成和色氨酸代谢等通路。此外，越冬期‘龙牧801号’与亚精胺、精氨基琥珀酸、NAGSA、L-丝氨酸和柠檬酸呈显著正相关，而与‘萨迪’相比，苹果酸和NAGSA含量更高。

3.4 DAMs探索性相关模块分析

通过WGCNA将304种DAMs分为六个模块，其中MEblue模块包含67种DAMs。该模块与POD、SOD、GSH、Pro、SS和MDA呈显著正相关（相关系数r分别为0.818、0.752、0.897、0.877、0.913和0.790）。亚精胺参与谷胱甘肽代谢，NAGSA与精氨酸和脯氨酸代谢相关，柠檬酸参与柠檬酸循环和辅因子生物合成，苹果酸参与丙酮酸代谢以及乙醛酸和二羧酸代谢。这四种代谢物被确定为与紫花苜蓿耐寒性相关的关键DAMs。

讨论与结论

讨论部分总结：研究人员指出，亚精胺可能通过增强抗氧化防御和维持渗透稳态来提高植物耐寒性。在本研究中，耐寒品种‘龙牧801号’中亚精胺积累增加，伴随较高的Pro、SS和GSH含量以及较低的MDA和H₂O₂水平，但其POD和SOD活性却更低，这可能反映了较低的氧化负担而非较弱的防御能力。谷胱甘肽作为关键的非酶抗氧化剂，在耐寒品种中含量更高，与较低的氧化损伤水平相关，但GSH/GSSG比值及相关酶活性未测定，因此其作用应视为关联性而非因果机制。NAGSA是精氨酸生物合成的中间体，可能与脯氨酸和亚精胺代谢相关联，但其在紫花苜蓿中的作用需进一步验证。苹果酸可能通过渗透调节、代谢调控和氧化还原稳态参与冷响应，其在耐寒品种中含量更高，但相关代谢通量未被测定。柠檬酸循环被认为是越冬期的关键代谢枢纽，耐寒品种中柠檬酸积累更多，可能为细胞提供更多ATP和代谢前体，但能量消耗过程和酶活性未被直接测量。研究人员强调，本研究仅为单一年份、单一地点的初步研究，观察到的关联性需通过多年多点实验、遗传分析和代谢流分析来验证。

研究结论翻译：

在本研究中，研究人员比较了越冬期间耐寒品种‘龙牧801号’和冷敏感品种‘萨迪’的根系。‘龙牧801号’的谷胱甘肽、可溶性糖、脯氨酸和蔗糖含量显著高于‘萨迪’，而过氧化物酶和超氧化物歧化酶活性以及H₂O₂、O₂^•-和丙二醛含量则显著较低。这些结果表明，‘龙牧801号’在冬季维持了更好的渗透稳态、更强的非酶抗氧化能力和更低的氧化损伤。较低的抗氧化酶活性可能反映了较低的氧化负担，而非较弱的抗氧化防御能力。越冬期间，在‘龙牧801号’和‘萨迪’之间鉴定出304种差异积累代谢物。MEblue模块中的差异积累代谢物与谷胱甘肽、脯氨酸和可溶性糖水平呈显著正相关。这些差异积累代谢物主要注释到谷胱甘肽代谢、精氨酸和脯氨酸代谢、丙酮酸代谢和三羧酸循环等通路。亚精胺、N-乙酰-L-谷氨酸-5-半醛、柠檬酸和苹果酸被进一步鉴定为与耐寒性相关的候选代谢物，可能有助于渗透调节、氧化还原调控、多胺代谢和能量代谢。然而，这些代谢物应被视为候选物而非确定的调控因子，其因果作用需要进一步的功能验证。总体而言，这项整合生理学和代谢组学的研究表明，紫花苜蓿根系的越冬耐寒性与谷胱甘肽代谢、精氨酸和脯氨酸代谢、丙酮酸代谢和三羧酸循环的协同变化有关。所鉴定的候选代谢物和通路，连同LC-MS数据集，为未来紫花苜蓿耐寒机制的功能研究提供了有价值的参考。这些发现为培育耐寒紫花苜蓿品种以及改善高纬度寒冷地区的越冬生产提供了理论依据和候选代谢标记物。