基于lrna-miRNA-mRNA ceRNA网络解析Acrossocheilus fasciatus感染Citrobacter freundii后脾脏的免疫调控特征

《Biology》：Integrated Analysis of the lncRNA-miRNA-mRNA ceRNA Network in the Spleen of Acrossocheilus fasciatus Infected with Citrobacter freundii

　　

为系统解析Acrossocheilus fasciatus（黄颡鱼）感染Citrobacter freundii（弗氏柠檬酸杆菌）后脾脏中长链非编码RNA（lncRNA）、环状RNA（circRNA）、微小RNA（miRNA）及信使RNA（mRNA）的表达谱特征，本研究整合组织病理学检查、TUNEL染色、免疫生理指标测定与全转录组测序技术开展分析。结果显示，感染导致肠道、脾脏和肾脏出现明显组织损伤，脾脏细胞凋亡显著增加，免疫生理参数发生显著改变。全转录组分析共鉴定出88个差异表达lncRNA、193个差异表达circRNA、140个差异表达miRNA及1935个差异表达mRNA。KEGG富集分析表明，差异表达mRNA主要富集于中性粒细胞胞外诱捕网形成、补体与凝血级联、抗原加工与呈递、细胞因子-细胞因子受体相互作用、吞噬体、趋化因子信号通路及IL-17信号通路等免疫相关通路。进一步构建了生物信息学预测的lncRNA-miRNA-mRNA ceRNA网络，该网络包含10个mRNA、14个lncRNA和22个miRNA，形成44个推定调控互作关系。在该网络中，miR-212-y可能介导对Il12rb2和PIK3R1的调控，而miR-8-y可能参与对Ccr9和PIK3R1的调控。qRT-PCR验证结果与RNA-seq表达趋势一致。本研究首次系统刻画了A. fasciatus感染C. freundii后脾脏非编码RNA与mRNA表达谱，并鉴定出潜在ceRNA调控网络，为阐明抗菌免疫机制及筛选抗病研究候选分子标记提供了重要参考。

研究背景：随着淡水养殖规模持续扩大与集约化程度提高，细菌性疾病已成为制约鱼类健康管理与养殖业可持续发展的主要瓶颈之一。Citrobacter freundii（弗氏柠檬酸杆菌）为肠杆菌科柠檬酸杆菌属革兰氏阴性条件致病菌，已在鲫（Carassius auratus）、草鱼（Ctenopharyngodon idellus）和大口黑鲈（Micropterus salmoides）等多种养殖鱼类中被检出。Acrossocheilus fasciatus（黄颡鱼）是中国南方新兴的经济性淡水鱼类，近年来随着人工养殖扩展，C. freundii感染已成为其养殖健康发展的严重障碍，亟需培育抗病力增强的品系。转录组测序可从全基因组层面解析感染前后基因表达变化，鉴定免疫相关通路、关键调控因子及潜在抗病分子标记，已成为水产病害研究中阐明病原感染、宿主免疫应答、组织损伤与抗菌防御机制的核心技术。此前已有转录组研究刻画了A. fasciatus抗C. freundii感染的脾脏mRNA水平免疫应答，但非编码RNA介导的转录后调控网络仍 largely 未被探索；且鱼类免疫应答具有高度组织特异性和感染阶段依赖性，仅基于mRNA的分析不足以全面揭示感染过程背后的复杂转录后调控机制。非编码RNA（ncRNA）包括miRNA、lncRNA和circRNA三大类，广泛参与前体RNA加工、内含子剪接、基因组重塑、细胞发育与分化及表观遗传调控等生物学过程。竞争性内源RNA（ceRNA）网络已成为重要调控模型，lncRNA可作为ceRNA或miRNA海绵，通过竞争共享miRNA结合位点降低miRNA对靶mRNA的抑制，形成动态多层调控网络，该网络已在黄颡鱼（Pelteobagrus fulvidraco）、豹纹鳃棘鲈（Plectropomus leopardus）及牡蛎等多种水生生物中被刻画。然而，对A. fasciatus感染C. freundii后lncRNA、circRNA、miRNA和mRNA的系统整合分析仍有限。本研究旨在评估C. freundii对A. fasciatus的致病效应，并全面刻画感染前后转录组变化，鉴定差异表达lncRNA和circRNA，构建lncRNA-miRNA-mRNA ceRNA调控网络，为阐明鱼类免疫调控机制及筛选抗病分子标记提供依据。

主要技术方法：研究人员从浙江衢州获取约6月龄健康A. fasciatus360尾，经14天暂养后，以180尾鱼随机分为6组（每组30尾）进行腹腔注射不同浓度C. freundii悬液（1×10⁸至1×10⁴ CFU/mL）的半数致死剂量（LD₅₀）测定，经Probit回归分析确定LD₅₀为2.08×10⁶ CFU/mL（相当于每尾2.08×10⁵ CFU）；其余180尾用于正式感染模型，设3个感染缸与3个对照缸（每缸30尾，每缸为独立实验单元），感染组腹腔注射0.1 mL LD₅₀剂量菌悬液，对照组注射等体积无菌1×PBS，于感染后0、24、48和72 h取样。关键技术包括：组织病理学苏木精-伊红（H&E）染色与TUNEL染色检测脾脏细胞凋亡；抗氧化酶活性（丙二醛MDA、总超氧化物歧化酶T-SOD、总抗氧化能力T-AOC）及免疫相关蛋白（补体成分3 C3、溶菌酶LZM、免疫球蛋白M IgM）测定；基于Illumina NovaSeq 6000平台的全转录组测序（sRNA-seq及lncRNA/circRNA/mRNA测序），采用CNCI、CPC、FEELnc三算法预测lncRNA编码潜能，find_circ鉴定circRNA，edgeR筛选差异表达，miRanda、TargetScan、RNAhybrid三算法预测miRNA靶基因，并基于cis/trans调控模式构建ceRNA网络；qRT-PCR验证转录组数据。所有实验经浙江师范大学实验动物伦理委员会批准（编号：ZSDW2025076）。

研究结果：
3.1 组织病理学分析：通过H&E染色观察到感染组肠道绒毛变形、上皮排列紊乱及杯状细胞空泡化，脾脏出现点状坏死、炎性细胞浸润和含铁血黄素沉积，肾脏出现肾小管变形和炎性细胞浸润；TUNEL染色显示感染后脾脏凋亡细胞比例显著增加，证实C. freundii感染诱导脾脏细胞死亡。
3.2 酶活性与免疫相关因子变化：感染后T-SOD活性总体升高，48和72 h显著高于0 h；T-AOC在24 h显著下降后于48和72 h明显升高；MDA含量24 h升高后下降；LZM活性24 h显著升高达峰后下降；IgM含量随感染时间逐渐升高，48和72 h显著升高；C3含量24和48 h略降后于72 h显著升高，表明宿主在感染早期启动抗氧化与溶菌酶介导的抗菌应答，后期增强抗体与补体介导的体液免疫。
3.3 lncRNA鉴定与特征：基于三算法重叠结果共鉴定1229个lncRNA，分为六类（sense 260、antisense 167、intronic 131、bidirectional 55、intergenic 472、other 144）；鉴定出88个差异表达lncRNA（43上调、45下调），重复样本一致性高且组间明显分离。
3.4 circRNA鉴定与特征：共鉴定15572个circRNA，按结构来源分六类，多数长度300–500 bp；鉴定出193个差异表达circRNA（112上调、81下调）；GO富集显示宿主基因主要富集于细胞过程、代谢过程、生物调控及刺激应答；KEGG富集显示显著富集于补体与凝血级联、NOD样受体信号通路、细菌侵袭上皮细胞及PI3K-Akt信号通路等免疫相关通路。
3.5 miRNA鉴定与特征：多数miRNA长度20–24 nt，以22 nt占比最大；鉴定出140个差异表达miRNA（74上调、66下调）；靶基因GO富集于细胞过程、代谢过程、生物调控及刺激应答；KEGG富集于内吞作用、MAPK信号通路及趋化因子信号通路等免疫相关通路。
3.6 mRNA鉴定与特征：鉴定出1935个差异表达基因（1294下调、641上调）；GO富集于细胞过程、代谢过程、生物调控、刺激应答及催化活性；KEGG富集于中性粒细胞胞外诱捕网形成、补体与凝血级联、抗原加工与呈递、细胞因子-细胞因子受体相互作用、吞噬体、趋化因子信号通路及IL-17信号通路等免疫相关通路。
3.7 免疫相关差异表达mRNA表达模式：选取7条通路中30个差异表达基因分析，ECM-受体互作通路中Lama3、LAMB3、Col4a2、THBS2显著下调而VTN显著上调；IL-17通路中PTGS2、il1b、ifng1、CXCL8、tnf显著上调；趋化因子通路中CXCL11.1、XCR1显著上调而CXCL14、CXCR4、CCR7显著下调；补体与凝血级联中C7、C3、C5、C8a、FGB显著上调；抗原加工与呈递通路中TAP1显著上调而LGMN、CTSL、H2-Ab1、H2-Aa显著下调；中性粒细胞胞外诱捕网与吞噬体通路中caspa显著上调而Tlr2、AQP9、c3ar1、MARCO显著下调。
3.8 lncRNA介导的ceRNA网络：基于免疫相关KEGG通路选取10个mRNA构建lncRNA-miRNA-mRNA共表达网络，包含10个mRNA、14个lncRNA和22个miRNA，形成44个推定调控互作；其中MSTRG.12201.1、MSTRG.20569.1、MSTRG.20573.1、MSTRG.6860.1预测与miR-212-y共享结合并靶向Il12rb2和PIK3R1；MSTRG.1229.1、MSTRG.7156.2预测结合novel-m0592-3p并调控下游CFH、CALR、FGB；MSTRG.20573.1、MSTRG.6860.1、MSTRG.6861.1可能通过miR-8-y调控Ccr9和PIK3R1。
3.9 qRT-PCR验证：随机选取6个差异表达基因、6个差异表达lncRNA和6个差异表达miRNA进行验证，18个转录本表达趋势均与RNA-seq结果一致，支持转录组分析跨平台可靠性。

讨论部分总结：本研究整合多层面技术系统刻画了A. fasciatus感染C. freundii后脾脏免疫调控特征，构建的lncRNA-miRNA-mRNA调控网络鉴定了关键免疫相关基因，可能有助于发现改善鱼类抗病力的潜在生物标志物。在致病效应方面，感染鱼出现腹部与鳍出血发红、肝脾充血肿大等典型临床症状，组织病理学显示肠道、脾脏和肾脏明显损伤；肠道结构完整性影响营养利用、屏障功能与生长性能，肾脏损伤提示局部炎症应答激活，脾脏点状坏死、炎性细胞浸润及含铁血黄素沉积结合TUNEL阳性细胞增加证实组织损伤。在免疫生理应答方面，感染早期病原刺激可能快速诱导活性氧（ROS）积累并消耗部分抗氧化储备，随后宿主增强SOD活性与总体抗氧化能力以清除过量ROS，MDA升高提示早期氧化应激与脂质过氧化；LZM早期升高表明快速启动溶菌酶介导抗菌应答，其后续下降可能与免疫消耗或病原免疫逃逸有关；IgM总体升高及C3后期显著升高表明后期增强抗体与补体介导体液免疫。在免疫稳态紊乱方面，差异表达基因富集于多条免疫相关通路，细胞因子显著上调表明诱导强烈促炎应答并促进免疫细胞募集，补体相关基因协同上调与C3含量升高一致，提示补体系统可能是防御关键通路；趋化因子信号相关基因的选择性变化反映免疫细胞募集与炎症强度的动态调控；caspa上调与脾脏凋亡增加一致，而Tlr2、AQP9、c3ar1、MARCO下调提示部分病原识别、补体受体信号与吞噬过程可能受抑制或反馈调节。在非编码RNA作用方面，circRNA宿主基因富集于补体与凝血级联、NOD样受体信号、细菌侵袭上皮细胞及PI3K-Akt信号等免疫相关通路，提示circRNA也可能参与细菌感染中的脾脏免疫调控；ceRNA网络中 miR-212-y与miR-8-y可能为关键miRNA，Il12rb2为IL-12受体信号重要组分并与T细胞、NK细胞免疫应答密切相关，PIK3R1编码PI3K调节亚基参与细胞存活、代谢、炎症信号与免疫细胞活化，Ccr9属趋化因子受体家族参与免疫细胞迁移与黏膜免疫定位，CCL25/CCR9轴可调控T细胞向特定部位募集，上述调控轴可能连接细胞因子信号与PI3K相关免疫转导，参与免疫细胞募集、炎症调控与病原清除。研究局限性包括：ceRNA调控轴与关键非编码RNA基于生物信息学预测与表达相关分析，直接调控关系与抗菌免疫功能尚未经基因敲降/过表达或双荧光素酶报告实验验证；候选分子与抗病力或存活结局的因果关系尚未在遗传群体或田间养殖条件下确立；仅选取感染后72 h单个时间点进行全转录组测序，不能完全捕捉整个感染过程的动态调控特征。未来将聚焦于miR-212-y/Il12rb2与miR-8-y/Ccr9调控轴在细胞与个体水平的功能验证、候选标记在自然或育种群体中的多态性与育种价值评估，以及时间序列转录组分析以揭示动态ceRNA调控格局。

研究结论翻译：综上所述，本研究首次对A. fasciatus感染C. freundii后lncRNA、circRNA、miRNA和mRNA进行了整合分析，鉴定出感染后88个差异表达lncRNA、193个差异表达circRNA、140个差异表达miRNA和1935个差异表达mRNA。构建的lncRNA-miRNA-mRNA ceRNA网络鉴定出若干潜在调控轴，尤其是由miR-212-y和miR-8-y介导的调控轴。这些发现为理解A. fasciatus抗菌免疫应答的分子机制提供了基础，并为筛选抗病研究分子标记提供了候选靶点。