《Journal of Bacteriology》：Identification of Vibrio cholerae proteins that bind 3′,3′-cyclic guanosine adenine dinucleotide
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环二核苷酸在抗噬菌体防御和正常细胞功能中均可作为信号分子。水平基因转移可将编码特定信号分子的抗噬菌体防御系统引入新宿主。这些新信号分子是否与现有宿主信号蛋白相互作用，以及这种相互作用是否具有进化意义，目前尚不清楚。霍乱弧菌（Vibrio cholerae）代表
环二核苷酸在抗噬菌体防御和正常细胞功能中均可作为信号分子。水平基因转移可将编码特定信号分子的抗噬菌体防御系统引入新宿主。这些新信号分子是否与现有宿主信号蛋白相互作用，以及这种相互作用是否具有进化意义，目前尚不清楚。霍乱弧菌（Vibrio cholerae）代表了一种通过抗噬菌体系统水平基因转移引入新型环二核苷酸信号分子的生物，该信号分子是由DncV产生的3′,3′-环鸟苷腺苷二核苷酸（3′,3′-cGAMP）。3′,3′-cGAMP可激活CapV磷脂酶活性，导致生长和泳动性降低。为了鉴定额外的3′,3′-cGAMP结合蛋白，研究人员对霍乱弧菌El Tor ORFeome进行了3′,3′-cGAMP结合筛选。除预期的3′,3′-cGAMP结合蛋白CapV和三种V-cGAP蛋白外，该筛选还鉴定出七个先前被发现可结合c-di-GMP的额外3′,3′-cGAMP结合蛋白。这七个蛋白均以更高的亲和力结合c-di-GMP，表明这些蛋白并非特异性结合3′,3′-cGAMP。研究人员通过测试DncV、CapV或两者在霍乱弧菌中的表达来评估3′,3′-cGAMP结合蛋白的功能。单独表达DncV不影响生长或泳动性，这与CapV共表达时的情况相反。在缺乏天然3′,3′-cGAMP信号通路的大肠杆菌（Escherichia coli）中，CapV和DncV共表达同样导致生长和泳动性降低。相反，同样缺乏内源性3′,3′-cGAMP的铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）对CapV和DncV共表达的敏感性较低。来自抗噬菌体系统的信号核苷酸主要在噬菌体防御中发挥作用，但当噬菌体压力减弱时，它们有可能调节其他过程。重要性：在这项研究中，研究人员系统地鉴定了霍乱弧菌中结合3′,3′-cGAMP的蛋白，该菌也使用类似的环二核苷酸c-di-GMP进行信号传导。除先前观察到的3′,3′-cGAMP结合蛋白（包括3′,3′-cGAMP激活的磷脂酶CapV和V-cGAP蛋白）外，该筛选还鉴定出七个同样结合c-di-GMP的新3′,3′-cGAMP结合蛋白。研究人员发现，3′,3′-cGAMP的产生和CapV磷脂酶活性对于抑制生长和泳动性既是必要的也是充分的，正如先前观察到的。在使用c-di-GMP但缺乏3′,3′-cGAMP信号通路的异源细菌中，3′,3′-cGAMP激活CapV磷脂酶同样需要抑制生长和泳动性，正如在霍乱弧菌中观察到的那样。这些结果表明，从抗噬菌体系统获得信号核苷酸可能进化为调节细胞过程。
本文系统研究了霍乱弧菌（Vibrio cholerae）中抗噬菌体信号分子3′,3′-环鸟苷腺苷二核苷酸（3′,3′-cGAMP）的蛋白质靶标及其功能意义。研究背景方面，原核生物面临噬菌体的持续压力，已进化出多种抗噬菌体防御系统，其中环寡核苷酸抗噬菌体信号系统（CBASS）通过产生环二核苷酸信号激活效应蛋白，诱导流产感染以限制噬菌体传播。细菌中常见的环二核苷酸如c-di-GMP和c-di-AMP参与调控多种细胞过程。由于这些分子结构相似，信号特异性对于避免在无噬菌体感染时激活致死性流产感染至关重要。然而，水平基因转移引入的抗噬菌体信号分子是否能够与宿主已有的信号蛋白发生交叉作用，进而影响宿主生理功能，仍是一个悬而未决的问题。第七次大流行霍乱弧菌El Tor菌株通过基因组岛VSP-1获得了capV和dncV基因，其中dncV编码的二核苷酸环化酶合成3′,3′-cGAMP，该分子可结合并激活CapV磷脂酶。此前研究发现dncV缺失影响泳动性和体内竞争能力，但后续研究对其感染期功能存在争议，提示3′,3′-cGAMP可能还存在其他靶标。因此，本研究旨在系统鉴定霍乱弧菌中结合3′,3′-cGAMP的蛋白，并评估其生理功能。
研究人员利用霍乱弧菌El Tor N16961的开放阅读框文库（ORFeome，含3,761个基因），通过DRaCALA（差异径向毛细管作用测定）筛选与32P标记的3′,3′-cGAMP结合的蛋白。除已知的CapV（VC0178）和三种3′,3′-cGAMP磷酸二酯酶V-cGAP1-3（VCA0210、VCA0681、VCA0931）外，还鉴定出七个新的候选蛋白：VC0815、VC1295、VC1348、VC1641、VC1652、VC2344（PlzC）和VCA0042（PlzD）。亲和力测定显示，CapV特异性结合3′,3′-cGAMP（解离常数Kd为0.4 μM），但不结合c-di-GMP；而其余蛋白对c-di-GMP的亲和力均高于对3′,3′-cGAMP的亲和力（3′,3′-cGAMP的Kd范围为0.1–13.9 μM）。竞争实验进一步表明，除CapV外，其他蛋白的3′,3′-cGAMP结合均可被未标记的c-di-GMP有效竞争，说明它们更偏好c-di-GMP。此外，研究人员测试了铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）中已知的c-di-GMP受体蛋白PilZ家族成员，发现其中三个（PA3353、PA4608、Alg44-PilZ）能以较低亲和力结合3′,3′-cGAMP，表明c-di-GMP结合蛋白交叉识别3′,3′-cGAMP的现象可能较为普遍。功能方面，在霍乱弧菌A1552、大肠杆菌RS128和铜绿假单胞菌PA14中异源表达dncV、capV或二者共表达，结果显示单独表达dncV或capV均不影响细胞生长和泳动性，而共表达capV-dncV导致菌落形成单位（CFU）下降3–4个数量级，并显著抑制泳动区直径和单细胞泳动速度。值得注意的是，3′,3′-cGAMP激活CapV引起的生长抑制和泳动缺陷在霍乱弧菌和大肠杆菌中明显，但在铜绿假单胞菌中效应较弱。单细胞追踪显示，在亚致死诱导浓度下，CapV-DncV共表达不影响化学趋向的方向改变频率，而高浓度诱导导致菌丝化，可能是泳动性降低的原因。
研究结果表明，在霍乱弧菌中，DncV产生的3′,3′-cGAMP的主要特异性靶标是CapV，通过激活其磷脂酶活性导致细胞活力下降和泳动抑制；而新鉴定的七个结合蛋白实际上更倾向于结合c-di-GMP，可能并不介导3′,3′-cGAMP特有的信号功能。讨论部分指出，目前所有测序的第七次大流行霍乱弧菌菌株均同时编码dncV和capV，支持该系统的主要功能仍为抗噬菌体防御。同时，在其他细菌如Geobacter sulfurreducens、Bdellovibrio bacteriovorus和Myxococcus xanthus中，3′,3′-cGAMP已被用作内源信号分子调节特定生理过程，提示抗噬菌体来源的信号核苷酸系统在失去噬菌体压力后有可能进化为细胞调控机制。研究结论可总结为：霍乱弧菌中3′,3′-cGAMP结合蛋白的筛选揭示了信号交叉识别现象，但3′,3′-cGAMP的主要功能仍是激活CapV以实现抗噬菌体防御；是否能够进一步演化出独立于防御的调控功能，尚需更多研究。
