马铃薯MAPK级联基因的全基因组鉴定及其对晚疫病响应表达模式分析

《Agronomy》：Genome-Wide Identification of MAPK Cascade Genes and Their Expression Patterns in Response to Potato Late Blight

　　

丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）级联是保守的信号模块，调控植物生长发育及对生物和非生物胁迫的响应。然而，马铃薯MAPK级联在全基因组层面的组织及其在致病疫霉（Phytophthora infestans）侵染过程中的转录响应仍未得到充分表征。本研究在马铃薯中鉴定到109个MAPK级联基因，包括17个StMAPKs、5个StMAPKKs和87个StMAPKKKs。系统发育、染色体定位、基因结构和保守基序分析揭示了清晰的家族水平保守性、StMAPKKKs中广泛的结构多样性以及多次串联重复事件。推测启动子分析显示，E-box、GT-1基序、MYB1AT、W-box和MYC元件几乎普遍存在（>95%的基因），而TGACG基序和CGTCA基序是主要的潜在顺式调控元件。在109个基因中，89个在接种致病疫霉后表达，包括17个StMAPKs、5个StMAPKKs和67个StMAPKKKs。值得注意的是，PGSC0003DMG400030058（MAPK3）、PGSC0003DMG401000057（MAPK4）和PGSC0003DMG400033696（MAPKK9）被强烈诱导，其表达在不亲和互作中增加2.3至3.5倍，在亲和互作中增加5.0至7.4倍，而13个基因在不亲和和亲和互作中均上调。拷贝数关联分析经错误发现率校正后，未检测到所检测的21个启动子元件中任何一个与感染诱导表达之间存在显著关系。这些结果为鉴定参与马铃薯-晚疫病互作的候选MAPK级联基因提供了全基因组框架，并为后续功能验证奠定了基础。

一、研究背景与意义

马铃薯（Solanum tuberosum L.）是全球仅次于小麦和水稻的第三大重要粮食作物，为人类营养提供必需的碳水化合物、膳食纤维、维生素和矿物质。然而，马铃薯生产面临多种病害的严重制约，其中由卵菌致病疫霉（Phytophthora infestans）引起的晚疫病危害最为严重，全球年损失超过67亿美元。在宿主定殖过程中，致病疫霉通过吸器将RxLR效应蛋白递送到植物细胞中以操控宿主免疫。这些效应蛋白可抑制模式触发免疫（PTI）或被核苷酸结合富亮氨酸重复（NLR）蛋白识别以激活效应子触发免疫（ETI），常伴随感染部位的超敏细胞死亡（HR）。PTI和ETI信号网络均以丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）级联作为核心磷酸化中继。

MAPK级联是真核生物中进化保守的信号模块，由三级激酶级联组成：MAPKKK、MAPKK和MAPK。在感知胞外刺激后，MAPKKK磷酸化MAPKK保守激活环基序中的丝氨酸/苏氨酸残基；活化的MAPKK随后磷酸化MAPK的TEY或TDY激活环基序；最后活化的MAPK转位至细胞核或细胞质，磷酸化转录因子及其他底物，从而将胞外信号转化为特定生理响应。在模式植物拟南芥（Arabidopsis thaliana）中，MAPK级联在免疫和胁迫信号中已被广泛表征。MEKK1-MKK4/5-MPK3/6级联通过诱导WRKY22/29转录因子作为抗真菌和细菌病原体的基础抗性正调控因子；而MEKK1-MKK1/2-MPK4通路负调控水杨酸依赖性免疫，同时正向介导干旱、寒冷和高盐响应。在主要作物中，功能研究同样证明了MAPK模块的关键作用。

尽管拟南芥、水稻等模式物种中MAPK级联知识丰富，但马铃薯中完整MAPK级联基因组的全基因组表征仍不完整。此前研究分别鉴定了20个StMAPKs和8个StMAPKKs、85个StMAPKKKs，或仅考察了单一胁迫条件下的MAPK表达。但这些研究要么仅关注级联的亚群，要么包含冗余条目，或未涉及致病疫霉侵染期间整个激酶组的转录动态。鉴于MAPK信号在植物-卵菌互作中的核心重要性以及马铃薯晚疫病的经济意义，亟需对马铃薯MAPK级联基因及其感染响应表达模式进行系统的全基因组分析。

二、主要技术方法

研究人员从Spud DB下载预测的马铃薯肽序列构建本地蛋白数据库，利用MAPK相关注释关键词检索候选基因，并通过Pfam Pkinase结构域模型PF00069.32进行hmmsearch检索。采用ClustalX 1.83进行多序列比对，MEGA 12.1以最大似然法构建系统发育树。基因结构通过Gene Structure Display Server可视化，保守基序用MEME Suite 5.5.4鉴定并经InterPro验证，亚细胞定位用DeepLoc-2.1预测。提取109个MAPK级联基因翻译起始密码子（ATG）上游2000 bp序列作为推定启动子区，分别用PlantCARE和New PLACE Signal Scan独立预测顺式元件。选取抗病品种紫云1号和感病品种Favorita，用致病疫霉分离株SCPZ16-3-1（2016年分离自四川省彭州市感病马铃薯叶片，未经任何遗传修饰）制备游动孢子悬浮液（5×10?个/mL）接种离体叶片。在接种前0 h及接种后24 h和48 h采集叶片样本，每个品种和时间点从5株植物采集叶片合并为一个样本，采用TRIzol试剂提取总RNA，由北京百迈客生物科技有限公司基于Illumina HiSeq2500平台完成RNA测序和FPKM表达估计。

三、研究结果

1. 1.
   马铃薯MAPK级联基因的鉴定与系统发育分析

通过关键词检索、hmmsearch和NCBI BLAST分析共鉴定到109个基因，包括17个StMAPKs、5个StMAPKKs和87个StMAPKKKs。三个家族的蛋白长度差异显著，StMAPK为242至613个氨基酸（平均463 aa），StMAPKK为333至515 aa（平均385.8 aa），StMAPKKK为96至1400 aa（平均446.4 aa）。系统发育分析显示所有MAPK、MAPKK和MAPKKK家族成员均可清晰聚类到各自对应分组。针对拟南芥MAPKKK参考序列的最大似然分类将48个StMAPKKKs归入MEKK样亚家族，29个归入Raf样亚家族，1个（PGSC0003DMG400007647）归入ZIK样亚家族；8个激酶结构域明显不完整的StMAPKKKs以及占据深分支基部位置的PGSC0003DMG400018751保持未分类状态。

1. 2.
   染色体分布与基因结构

基于v4.03基因组版本，109个基因全部定位到12条马铃薯染色体上，分布不均匀。2号和6号染色体各含16个基因（14.7%），7号染色体含13个基因（11.9%），9号染色体仅含2个基因（1.8%）。5个MAPKK基因中有4个位于3号染色体，而87个MAPKKK基因集中在2号（15个）、6号（13个）、7号（10个）和8号（10个）染色体。串联重复分析在6号染色体（3个簇，9个基因）和7号染色体（2个簇，7个基因）发现显著簇。值得注意的是，7号染色体约46.0-46.2 Mb区域检测到密集的5基因簇，6号染色体约45.5-45.6 Mb处有4基因簇。转录方向上，45个基因（41.3%）位于正链，64个（58.7%）位于负链。非均匀染色体分布和多个串联基因簇的存在表明串联重复对马铃薯MAPK级联基因的扩张有重要贡献。基因结构方面，外显子数量从1到17不等，据此分为三个主要结构组：I组含40个无内含子基因（36.7%），长度291至1380 bp；II组含17个含2至5个外显子的基因（15.6%），长度610至6487 bp；III组含52个含6至17个外显子的基因（47.7%），长度2316至16948 bp。

1. 3.
   StMAPK、StMAPKK和StMAPKKK蛋白的保守基序分布

MEME Suite分析显示StMAPK蛋白具有最完整的典型激酶特征。P-loop、HRD和APE基序各在16个StMAPK成员中检测到（94.1%），TEY/TDY激活环基序（MAPK蛋白的标志）在15个成员中检测到（88.2%）。VAIK基序在12个StMAPK蛋白中检测到（70.6%），DFG基序在15个中检测到（88.2%）。TEY型和TDY型MAPK的同时存在表明马铃薯MAPK家族内部已发生分化。5个StMAPKK蛋白含有S/T-X?-S/T双磷酸化基序但缺乏TEY/TDY基序，与其作为MAPK上游激活因子的地位一致。相比之下，87个StMAPKKK蛋白表现出最大的基序多样性，P-loop在37个成员中检测到（42.5%），VAIK基序在14个中（16.1%），TEY/TDY基序在23个中（26.4%）。共现分析显示最常见的基序对是DFG与S/T-X?-S/T（85%）、APE与S/T-X?-S/T（74%）以及DFG与APE（70%）。

1. 4.
   MAPK级联基因推定启动子区的顺式调控基序

在21个预先从文献中选定的基序中，5个元件几乎普遍存在：GT-1基序在108个基因中检测到（99.1%；2784个拷贝），E-box在107个基因中（98.2%；1438个拷贝），MYB结合位点MYB1AT在107个基因中（98.2%；985个拷贝），WRKY结合W-box在107个基因中（98.2%；1756个拷贝），MYC结合位点在104个基因中（95.4%；590个拷贝）。其他丰富元件包括乙烯响应元件ERE（95个基因，87.2%）、ABA响应ABRE（83个基因，76.1%）、I-box（80个基因，73.4%）、G-box（78个基因，71.6%）和SA响应TCA元件（71个基因，65.1%）。茉莉酸响应TGACG和CGTCA基序各在64个基因中检测到（58.7%）。SARE和JERE未检测到，GCC-box和EIRE仅出现在少数推定启动子区。共检测到9756个元件拷贝（平均每个推定启动子区89.5个）。共现分析显示W-box和MYB1AT在106个基因中共现，MYB1AT和MYC在103个基因中共现，W-box和MYC在103个基因中共现，W-box和TGACG基序在64个基因中共现。基于检测频率和功能注释，21个基序形成三类：普遍元件（>95%基因）、丰富胁迫和激素响应元件（55-87%基因）以及低频特化元件（<32%基因）。

1. 5.
   致病疫霉侵染后MAPK级联基因的表达谱

在抗病品种紫云1号和感病品种Favorita中，于0 hbi、24 hpi和48 hpi采集叶片样本进行转录组分析。共获得321,225,032条干净读段（40.15 Gb序列数据），平均测序深度56.89×，各样本Q30以上碱基比例超过90%，比对率71.13%至74.70%。共89个MAPK级联基因在侵染过程中表达，包括17个StMAPKs、5个StMAPKKs和67个StMAPKKKs。在抗病紫云1号中，MAPK3编码基因PGSC0003DMG400030058从接种前0 h的18.09 FPKM增至24 hpi的28.59和48 hpi的64.02 FPKM；在感病Favorita中从33.74 FPKM增至70.39和188.36 FPKM。MAPK4编码基因PGSC0003DMG401000057在紫云1号中从11.37 FPKM诱导至25.91 FPKM，在Favorita中从8.68 FPKM增至63.97 FPKM。MAPKK9编码基因PGSC0003DMG400033696在R0、R24、R48、S0、S24和S48中的FPKM值分别为44.51、122.34、101.70、34.39、172.60和76.50。趋势分析鉴定出紫云1号中19个和Favorita中32个上调的MAPK级联基因。13个基因在两个品种中均上调，包括2个MAPK基因（PGSC0003DMG400030058、PGSC0003DMG401000057）和11个MAPKKK基因。其中PGSC0003DMG400030058、PGSC0003DMG400029693和PGSC0003DMG400032242在亲和和不亲和互作的前48 h内持续上调。基因组邻近性分析显示，7号染色体簇中5个表达基因的成对表达相关性高于7号染色体上其他表达基因对（Mann-Whitney检验，p = 0.0028），但经Benjamini-Hochberg校正后无一显著，该结果仅为探索性共表达信号。

四、讨论与结论

讨论部分指出，此前研究鉴定的马铃薯MAPK基因存在冗余或错误注释。Zaynab等鉴定的22个StMAPKs中有6个经BlastX分析无法与任何MAPK蛋白比对，而与shaggy相关蛋白激酶epsilon异构体X2、周期蛋白依赖性激酶或细胞分裂控制蛋白高度一致。Shang等鉴定的20个StMAPKs和8个StMAPKKs中存在多个重复条目，去冗余后仅剩14个StMAPKs和5个StMAPKKs。本研究经仔细序列比对后鉴定到109个MAPK级联基因。StMAPK3和StMAPK4在抗病和感病品种中的表达均增强，表明其可能参与通用病原体响应信号而非仅品种特异性抗性。StMAPKK9的强烈诱导表明MAPKK介导的信号传递在侵染过程中可能很重要。Favorita中诱导的MAPKKK基因数量更多不应自动解释为赋予抗性，感病植株可能激活广泛但不足的防御响应。13个在两个品种中均上调的基因，尤其是持续诱导48 h的PGSC0003DMG400030058、PGSC0003DMG400029693和PGSC0003DMG400032242，是功能分析的优先候选基因。StMAPK3携带33个W-box拷贝（全部109个推定启动子区中最高，家族平均值16.1），StMAPKK9显示最高总元件负荷（132个拷贝）。但拷贝数关联分析经多重检验校正后未检测到显著关系。研究强调表达数据来自合并样本，未进行差异表达统计检验，且原始实验未包含时间匹配的模拟接种对照，观察到的表达变化也可能反映孵育条件、昼夜节律或叶片离体响应。感染响应的MAPK级联基因是候选基因，其转录诱导本身并不确立在抗性中的积极作用，因果参与有待通过基因沉默或过表达等功能验证。

研究结论翻译：本研究鉴定并系统表征了109个马铃薯MAPK级联基因。该基因集包含17个StMAPKs、5个StMAPKKs和87个StMAPKKKs，MAPK和MAPKK蛋白通常比MAPKKK蛋白表现出更高的基序保守性。不均匀的染色体分布和串联重复簇表明基因重复对马铃薯MAPK级联的扩张有所贡献。启动子分析揭示了广泛的碱性和潜在防御相关顺式元件库，尽管经多重检验校正后元件拷贝数与表达模式无显著关联。致病疫霉侵染后，89个基因表达，MAPK3、MAPK4、MAPKK9和几个MAPKKK基因表现出强烈的转录响应。13个基因在抗病和感病互作中均被诱导，为未来功能研究提供了聚焦的候选基因集。这些发现共同为解析马铃薯晚疫病抗性中MAPK介导的信号传导建立了全基因组资源。