《Agronomy》：Forty-Eight of Maize Monoculture Under Contrasting Tillage Affect Short-Term Microbial Responses to Azoxystrobin and Vermicompost
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嘧菌酯是一种广泛使用的甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂，然而，在长期连作系统中土壤微生物如何响应过量暴露，以及有机改良能否缓解这种响应，仍知之甚少。研究人员开展了一项为期30天的温室试验，所用土壤采自1975年以来分别在常规耕作（LC）和免耕（SD）条件下维持的玉米连作
嘧菌酯是一种广泛使用的甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂，然而，在长期连作系统中土壤微生物如何响应过量暴露，以及有机改良能否缓解这种响应，仍知之甚少。研究人员开展了一项为期30天的温室试验，所用土壤采自1975年以来分别在常规耕作（LC）和免耕（SD）条件下维持的玉米连作田。研究人员按推荐剂量（DR1X，5 mg kg?1）和十倍推荐剂量（DR10X）施用嘧菌酯，同时设置添加或不添加蚯蚓粪（VC，50 g kg?1）的处理。分析方法包括16S rRNA基因测序、脂肪酸甲酯（FAME）谱分析和偏最小二乘结构方程模型（PLS-SEM）。DR10X显著降低了两种耕作系统中革兰氏阳性菌生物标志物的相对丰度，并在LC条件下使真菌/细菌比值提高了50%，但未降低总微生物生物量。蚯蚓粪提高了土壤pH值和电导率，并且在无杀菌剂情况下增加了物种丰富度，还逆转了LC条件下DR10X引起的真菌/细菌比值升高；然而，在LC条件下，经蚯蚓粪改良的杀菌剂处理中，绿弯菌门（Chloroflexi）和浮霉菌门（Planctomycetota）的相对丰度降至最低水平。香农多样性指数未受影响，而皮卢均匀度指数仅在LC条件下、无论是否添加蚯蚓粪，均在DR10X处理中有所增加。土壤化学性质仅在SD条件下能显著预测FAME生物标志物；大多数其他PLS-SEM路径不显著。微生物对嘧菌酯的响应取决于土壤管理方式，而蚯蚓粪的作用具有类群特异性，而非保护性。
研究背景与科学问题
农业土壤健康是保障作物可持续生产的基础。嘧菌酯（azoxystrobin）作为全球应用最广泛的甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂之一，通过与病原真菌线粒体细胞色素bc1复合物结合、抑制ATP合成来发挥药效，但其在土壤中的残留期可达数周至数月，引发了对非靶标微生物及土壤长期功能的担忧。已有研究表明，嘧菌酯暴露会降低有益微生物类群的丰度并抑制脱氢酶、脲酶和磷酸酶等关键土壤酶的活性。然而，这些响应并不一致，其程度强烈依赖于土壤有机质含量和pH值等内在属性。在长期连作系统中，由于土壤结构退化、养分失衡及外源有害物质累积，微生物群落对化学胁迫的敏感性可能被进一步放大。此外，耕作制度决定了土壤有机碳的垂直分层和组分的有序性，从而形成独特的生态位，而常规翻耕（conventional tillage, LC）和免耕（no-tillage, SD）这两种截然不同的土壤管理模式可能塑造出基线敏感度迥异的微生物群落。尽管已有大量短期孵化实验，但针对长期连作背景下不同耕作制度土壤微生物对杀菌剂过量暴露的响应，尤其是高剂量（如10倍推荐剂量）的影响，以及蚯蚓粪（vermicompost, VC）能否有效缓解这种胁迫，目前仍缺乏基于高通量分子工具的系统评估。为此，本研究利用16S rRNA基因扩增子测序技术，旨在填补上述三个关键空白：即现有研究多依赖生化代理指标或培养法、对极端暴露情景了解不足、以及蚯蚓粪在高杀菌剂压力下的潜在缓解作用尚不明确。
研究方法概述
研究人员从阿根廷科尔多瓦省马科斯华雷斯（Marcos Juárez）的一个始于1975年的长期定位试验站采集表层（0–15 cm）土壤样品。该站点包含两种耕作制度：常规翻耕（LC）和免耕（SD），均处于玉米连作并施氮磷硫肥的管理模式下。温室试验采用析因设计，共设36盆（每盆500 g风干土），每种耕作制度下各18盆，涵盖6种组合处理：对照、推荐剂量嘧菌酯（DR1X，5 mg kg?1）、十倍推荐剂量嘧菌酯（DR10X，50 mg kg?1），以及分别对应以上三种处理的蚯蚓粪添加组（50 g kg?1），每组3个生物学重复。处理30天后采样，主要关键技术方法包括：（1）土壤化学分析：测定pH、电导率（EC）、总有机碳（TOC）和硝态氮浓度；（2）脂肪酸甲酯（FAME）谱分析：通过气相色谱法定量总微生物生物量及革兰氏阳性菌（G+）、革兰氏阴性菌（G?）、放线菌和真菌的生物标志物；（3）16S rRNA基因扩增子测序：扩增V4区，利用QIIME 2进行序列去噪、聚类为扩增子序列变异体（ASV），并通过SILVA数据库注释分类；（4）数据统计：采用双因素方差分析（two-way ANOVA）和Fisher最小显著差数法（LSD）进行多重比较，同时构建偏最小二乘结构方程模型（PLS-SEM）揭示处理、土壤化学参数、FAME生物标志物、优势菌门及α多样性指数之间的因果路径。
研究结果
3.1 土壤化学分析
土壤pH受耕作制度、处理及其交互作用的显著影响。总体而言，LC土壤的pH高于SD土壤。蚯蚓粪添加普遍提升了pH值，但在不同耕作制度下提升幅度存在差异。例如，LC条件下DR1X VC和DR10X VC的pH显著高于各自的无蚯蚓粪对照，而SD条件下DR10X VC将pH提升至最高水平之一。土壤电导率（EC）同样受耕作制度、处理及其交互作用的显著影响。SD土壤的EC整体高于LC土壤，蚯蚓粪添加在所有处理中均一致性地提高了EC。在LC中，DR10X显著降低了EC，而DR10X VC则表现出最高的EC值。总有机碳（TOC）方面，SD土壤的TOC显著高于LC土壤，蚯蚓粪的增效作用在LC中更为明显，尤其是在DR1X VC和DR10X VC处理中TOC达到最高；而在SD中，仅DR10X VC显著高于无蚯蚓粪对照。硝态氮浓度也呈现显著的交互效应：LC条件下，DR10X的硝态氮最低，而蚯蚓粪添加（尤其是DR10X VC）大幅提升了硝态氮水平；SD条件下，无蚯蚓粪的杀菌剂处理与对照无显著差异，但Control VC和DR1X VC的硝态氮显著升高，而DR10X VC却未表现出类似的提升。土壤C/N比在各处理间变化幅度窄，LC中DR1X VC和DR10X VC的C/N比略有降低，而SD中所有处理间无显著差异。
3.2 微生物脂肪酸分析
革兰氏阳性菌（G+）生物标志物受耕作制度、处理及其交互作用的显著影响。SD土壤的G+生物标志物整体高于LC。蚯蚓粪添加通常降低了G+生物标志物，尤其在Control VC和DR1X VC中表现显著，但DR10X VC与DR10X相比无显著差异。真菌生物标志物方面，LC土壤的真菌生物标志物整体高于SD。LC条件下，DR10X的真菌生物标志物最高，显著超过对照及其对应的蚯蚓粪处理；而DR10X VC则回落至对照水平。SD条件下，DR10X VC反而表现出最高的真菌生物标志物。放线菌生物标志物的响应较为复杂：LC中对照的放线菌最高，DR10X和DR1X VC最低；SD中DR10X的放线菌最高，DR1X最低。G+/G?比值受耕作制度、处理及其交互作用的显著影响，SD土壤的比值整体高于LC。蚯蚓粪添加在两个耕作制度下均一致性地降低了该比值，表明群落向更富营养型方向转变。真菌/细菌（F/B）比值在LC中整体高于SD。LC条件下，DR10X的F/B比值最高，而DR10X VC显著低于DR10X，表明蚯蚓粪部分逆转了高剂量杀菌剂导致的真菌相对优势。SD条件下，蚯蚓粪添加在所有处理中均提高了F/B比值。总微生物生物量（ΣFAME）在处理间差异显著，蚯蚓粪添加普遍提高了总生物量，尤其在LC的Control VC和DR10X VC以及SD的所有蚯蚓粪处理中表现最为突出。
3.3 细菌群落组成（门水平）
细菌群落主要由放线菌门（Actinobacteriota）、变形菌门（Proteobacteria）、浮霉菌门（Planctomycetota）、绿弯菌门（Chloroflexi）、酸杆菌门（Acidobacteriota）和厚壁菌门（Firmicutes）组成。中心化对数比（CLR）转换后的相对丰度热图显示，这些优势菌门在不同耕作制度和处理间呈现出显著的管理依赖性分布模式。绿弯菌门在LC中整体更丰富，DR1X处理下达到最高丰度，而蚯蚓粪改良的杀菌剂处理（DR1X VC和DR10X VC）则降至最低水平。浮霉菌门同样在LC中更丰富，DR1X最高，DR1X VC和DR10X VC最低。变形菌门在SD中整体更丰富，DR10X VC处理下达到最高丰度，而LC中DR10X最低。放线菌门的主效应不显著，但在LC中Control VC显著高于对照，而在SD中DR1X VC显著低于DR1X。厚壁菌门在SD中整体更丰富，LC中DR10X最高，而DR10X VC显著低于DR10X；SD中DR1X最高，蚯蚓粪添加在DR1X VC和DR10X VC中均降低了厚壁菌门的丰度。酸杆菌门在SD中整体更丰富，两个耕作制度下Control VC均显著高于对照，而DR1X VC均显著低于DR1X。
3.4 α多样性指数
香农多样性指数不受处理、耕作制度或其交互作用的显著影响。Chao-1指数和观测到的物种丰富度指数仅受处理因素的显著影响：无杀菌剂条件下添加蚯蚓粪（Control VC）在两个指数中均表现出最高值，显著高于无蚯蚓粪对照及其他大部分处理，表明蚯蚓粪在无杀菌剂胁迫下能显著提升细菌群落丰富度。皮卢均匀度指数仅受耕作制度与处理交互作用的显著影响：在LC条件下，DR10X VC和DR10X的均匀度显著高于对照，而SD条件下各处理间无显著差异。
3.5 结构方程模型
PLS-SEM分析揭示了耕作制度对处理-化学-微生物级联关系的差异化调控。在LC条件下，仅有处理对FAME生物标志物的直接路径显著（β = ?0.590, p = 0.041），效应量大（f2 = 0.692），其余路径均不显著，且多样性指数的解释力很低（R2 = 0.147）。在SD条件下，化学参数对FAME生物标志物的预测路径显著（β = 0.793, p = 0.002, f2 = 3.017），处理对优势菌门的直接路径也显著（β = ?0.748, p = 0.024），且FAME和菌门的解释力很高（R2分别为0.820和0.618），多样性指数的解释力中等（R2 = 0.543）。这表明，在SD系统中，土壤化学性质可作为FAME生物标志物组成变化的有效代理，而LC系统中则需要直接的微生物谱分析才能捕捉到处理效应。
3.6 相关性分析
Pearson相关分析显示，土壤pH与G+菌、放线菌及G+/G?比值呈负相关，而与G?菌、真菌及F/B比值呈正相关。EC与G?菌、放线菌及总生物量呈正相关。TOC与G+菌、放线菌、G+/G?比值及总生物量呈正相关，与真菌及F/B比值呈负相关。硝态氮与放线菌和总生物量呈正相关，与真菌和F/B比值呈负相关。在菌门层面，pH与绿弯菌门和浮霉菌门呈负相关，与变形菌门呈正相关；EC与绿弯菌门和厚壁菌门呈负相关，与变形菌门呈正相关；TOC与酸杆菌门和厚壁菌门呈负相关，与浮霉菌门呈正相关；硝态氮与厚壁菌门呈负相关，与浮霉菌门呈正相关。
讨论总结与结论翻译
讨论总结：本研究的核心发现是，嘧菌酯对土壤微生物群落的影响不能仅由剂量预测，而是高度依赖于土壤的耕作历史。十倍推荐剂量并未导致α多样性的全面下降，而是引发了群落组成的重组——革兰氏阳性菌生物标志物减少、真菌/细菌比值升高，这种重组在常规耕作（LC）下尤为剧烈。蚯蚓粪虽然在一定程度上缓冲了化学胁迫（如提高pH、EC和硝态氮，逆转F/B比值升高，并在无杀菌剂时提升丰富度），但其效果是类群特异性的，而非全面的保护性修复：在LC条件下，蚯蚓粪未能将绿弯菌门和浮霉菌门恢复至对照水平。PLS-SEM进一步表明，在免耕（SD）系统中，土壤化学性质可部分作为FAME生物标志物组成变化的代理指标；而在LC系统中，唯一的显著路径是从处理直接指向生物标志物，绕过了土壤化学变量，因此这类土壤可能需要直接的微生物谱分析来评估杀菌剂效应。在两个系统中，土壤化学性质均无法预测多样性结局。这些结果强调，杀菌剂风险评估不能采用单一协议，应结合长期耕作制度背景，并建议在常规耕作土壤中严格按标签剂量使用嘧菌酯，同时将蚯蚓粪视为综合管理策略的一部分，而非纠正过度用药的万能手段。
研究结论翻译：嘧菌酯对土壤微生物群落的影响不能仅由剂量预测。十倍剂量重组了群落组成，降低了革兰氏阳性菌生物标志物并提高了真菌/细菌比值，但未降低α多样性。这种重组及其与土壤化学性质的耦合关系严重依赖于土壤的耕作历史。研究人员的假设得到了部分支持。高剂量暴露使群落向更耐胁迫的谱型转变，且在常规耕作下响应更强。蚯蚓粪缓冲了部分响应，改善了土壤化学条件，并在无杀菌剂情况下增加了丰富度。然而，其作用是类群选择性的而非完全逆转，因为在常规耕作下，绿弯菌门和浮霉菌门未被恢复至对照样丰度。因此，杀菌剂效应的监测不能在不同农业情境下遵循同一方案。在免耕条件下，土壤化学性质与FAME生物标志物相关联，可作为组成变化的局部代理。在常规耕作条件下，唯一显著的路径直接从处理指向生物标志物，绕过了土壤化学性质，因此这些土壤可能需要直接的微生物谱分析。在两个系统中，土壤化学性质均无法预测多样性结局。这些结果支持仅在病害压力证明必要时按标签剂量施用嘧菌酯，特别是在常规耕作土壤中，并将蚯蚓粪视为管理策略的一个组成部分，而非纠正杀菌剂过量的补救措施。
