《Advanced Agrochem》：Host-Guest Engineering for Plant Stress Adaptation through a Methyl-
β-Cyclodextrin-Melatonin Supramolecular Complex
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全球变暖驱动的气候变化显著增加了极端天气事件（包括干旱和洪涝）的发生频率和严重程度。与此同时，全球气温上升使植物暴露于盐渍、干旱和洪涝等一系列非生物胁迫（abiotic stresses）之中，严重制约了植物生长和生产力。据预测，到2050年粮食需求将较201
全球变暖驱动的气候变化显著增加了极端天气事件（包括干旱和洪涝）的发生频率和严重程度。与此同时，全球气温上升使植物暴露于盐渍、干旱和洪涝等一系列非生物胁迫（abiotic stresses）之中，严重制约了植物生长和生产力。据预测，到2050年粮食需求将较2010年增加62%，而主要作物的产量在气候变化情景下预计将下降，全球粮食安全面临的挑战进一步加剧。因此，可持续的作物集约化生产需求变得尤为紧迫。然而，由于反复发生的严重干旱和洪涝导致的耕地退化和丧失，其实施日益受到制约。除农业系统外，气候变化还影响着生物多样性格局，使众多具有药用价值的植物物种濒临灭绝。近年来，生物刺激剂（biostimulants）因其在促进植物生长和增强非生物胁迫抗性方面的作用而受到广泛关注。其中，褪黑素（MLT）作为一种多功能吲哚胺，被认为是植物生理过程的主调控因子，已成为提高非生物胁迫耐受性的有前景的生物刺激剂。在非生物胁迫条件下，外源施用MLT可延缓叶片衰老、减轻光抑制并促进植物生长。此外，MLT已被证明在采后作物管理和品质保持中发挥作用。尽管具有这些 promising 特性，MLT在农业中的实际应用仍因其在环境条件下的稳定性差而受限。MLT对pH、紫外辐射和温度波动等因素高度敏感，施用后的快速径流和降解进一步降低了其在田间环境中的持久性和有效性。环糊精（CDs）是淀粉经酶降解获得的环状寡糖，由通过α-1,4-糖苷键连接的吡喃葡萄糖单元组成。天然CDs有三种类型，分别由六个、七个和八个吡喃葡萄糖单元组成，相应地命名为α-环糊精（α-CD）、β-环糊精（β-CD）和γ-环糊精（γ-CD）。CDs呈现截锥形结构，具有疏水性内腔和亲水性外表面。CDs的这种独特结构天然能够通过形成主客体组装体（通常称为包合物，IC）来封装疏水性分子。已知IC可改善被封装分子的水溶性、热稳定性和释放性能。然而，CD-IC在稳定MLT和增强其作为植物生物刺激剂功效方面的潜力尚在很大程度上未被探索。因此，研究人员假设CD介导的MLT封装可以克服游离MLT的固有局限性（包括溶解性有限和稳定性差），从而增强其在暴露于不利环境条件下的植物中的胁迫保护效应。在本研究中，研究人员开发了MLT与M-β-CD的1:1主客体包合物（基于相溶解度研究选择），并利用1H核磁共振（1H NMR）波谱、二维核Overhauser效应波谱（2D-NOESY）、扫描电子显微镜（SEM）、傅里叶变换红外（FTIR）波谱、粉末X射线衍射（PXRD）、差示扫描量热法（DSC）和热重分析（TGA）对超分子复合物进行了全面表征。此外，在多种非生物胁迫条件下评估了所开发IC的生物学功效，包括拟南芥（Arabidopsis thaliana）中的盐胁迫和渗透胁迫，以及印度缬草（Valeriana jatamansi）中的干旱和洪涝胁迫。评估了游离MLT、M-β-CD和IC对植物生长、形态生理性状和光合色素的影响。此外，还研究了印度缬草中次生代谢物积累以及与环烯醚萜生物合成途径相关基因的表达。因此，本研究的主要重点在于提出一种改善MLT溶解性和稳定性的超分子策略，为增强植物在气候变化驱动的非生物胁迫下的适应性和生产力提供有前景的方法。
研究背景：全球变暖驱动的气候变化显著增加了干旱、洪涝等极端天气事件的发生频率和严重程度，全球气温上升使植物暴露于盐渍、干旱和洪涝等多种非生物胁迫（abiotic stresses）之中，严重制约植物生长和生产力。据预测，到2050年粮食需求将较2010年增加62%，而主要作物产量在气候变化情景下预计下降，可持续作物集约化生产的需求日益紧迫。然而，耕地退化和丧失使其实施受到制约。气候变化还影响生物多样性格局，使众多药用植物物种濒临灭绝。近年来，生物刺激剂（biostimulants）因促进植物生长和增强非生物胁迫抗性而受到广泛关注。褪黑素（MLT）作为一种多功能吲哚胺，被认为是植物生理过程的主调控因子，已成为提高非生物胁迫耐受性的有前景的生物刺激剂。在胁迫条件下，外源施用MLT可延缓叶片衰老、减轻光抑制并促进植物生长，且在采后作物管理和品质保持中发挥作用。然而，MLT在实际农业应用中因环境稳定性差而受限，其对pH、紫外辐射和温度波动高度敏感，施用后快速径流和降解进一步降低其田间持久性和有效性。环糊精（CDs）是淀粉经酶降解获得的环状寡糖，由α-1,4-糖苷键连接的吡喃葡萄糖单元组成，天然存在α-CD、β-CD和γ-CD三种类型，呈截锥形结构，具有疏水性内腔和亲水性外表面，可通过形成主客体包合物（IC）封装疏水性分子，改善被封装分子的水溶性、热稳定性和释放性能。然而，CD-IC在稳定MLT和增强其植物生物刺激剂功效方面的潜力尚在很大程度上未被探索。因此，研究人员假设CD介导的MLT封装可克服游离MLT溶解性有限和稳定性差的固有局限性，从而增强其胁迫保护效应。
研究内容与结论：研究人员开发了MLT与M-β-CD的1:1主客体包合物，通过相溶解度研究进行选择，并利用
1H NMR、2D-NOESY、SEM、FTIR、PXRD、DSC和TGA对超分子复合物进行全面表征。在拟南芥中评估了盐胁迫（100和150 mM NaCl）和渗透胁迫（10% PEG）下的生物学功效，在印度缬草中评估了干旱和洪涝胁迫下的效果，测定了植物生长、形态生理性状、光合色素、次生代谢物积累及环烯醚萜生物合成途径相关基因表达。结论表明，将MLT封装于M-β-CD中可改善其溶解性、稳定性和对一系列非生物胁迫的保护功效，IC持续优于游离MLT，帮助拟南芥和印度缬草在盐渍、干旱和洪涝等挑战性条件下维持生长、色素含量和光合效率，并支持印度缬草中生物活性化合物积累和有益基因表达模式的维持。值得注意的是，M-β-CD表现出超越载体功能的保护效应，凸显其作为植物胁迫耐受性独立调节剂的潜力。总体而言，MLT/M-β-CD包合物（IC）是增强植物适应性和维持气候变化下药用作物生产力的有前景策略，为气候智能型和可持续农业提供了多功能平台。此外，基于M-β-CD的络合为农业中MLT递送提供了潜在实用且经济有效的方法，但其大规模应用的经济可行性尚需进一步验证。
关键技术方法：研究人员通过相溶解度分析（相溶解度图、Higuchi-Connors方程计算表观稳定常数Ks）筛选环糊精类型，采用溶剂蒸发结合冷冻干燥法制备包合物，通过RP-HPLC测定MLT含量和载药效率；利用
1H NMR和2D-NOESY研究主客体质子相互作用，结合SEM、ATR-FTIR、PXRD、DSC和TGA进行固态表征；采用透析袋法在pH 5.5和7.4条件下进行体外释放研究；以拟南芥Col-0生态型进行盐胁迫和渗透胁迫实验，以印度缬草cv. Himbala进行干旱和洪涝胁迫实验；通过叶绿素荧光成像系统和便携式叶绿素荧光仪测定光合性能，分光光度法测定光合色素和花青素含量，RP-HPLC定量缬草三酯和倍半萜类化合物，qRT-PCR分析环烯醚萜生物合成途径7个关键基因的表达，并采用Pearson相关分析评估形态生理参数间的关联。
研究结果：
3.1 包合物（IC）的开发：相溶解度图显示MLT溶解度随CD浓度增加呈线性增加，为AL型曲线，表明1:1摩尔化学计量比包合。MLT在M-β-CD中的溶解度高于β-CD和HP-β-CD，Ks值为410.99 M
-1，处于200-5000 M
-1的理想络合效率范围内。据此制备M-β-CD与MLT的主客体组装体，载药效率为13.96 ± 0.25%。
3.2 MLT/M-β-CD包合物（IC）的表征：NMR波谱分析显示IC谱中MLT芳香质子出现轻微位移，表明存在非共价相互作用，且无新峰出现表明未形成共价键；2D-NOESY谱揭示MLT芳香质子与M-β-CD内部质子（H-3和H-5）之间存在交叉峰，证明空间邻近，提示MLT被包合于M-β-CD腔内。SEM显示IC具有区别于各单一组分的独特形态。FTIR显示IC中M-β-CD的O-H伸缩带从3392移至3376 cm
-1，表明存在氢键，且MLT指纹区特征峰被掩盖。PXRD显示MLT结晶峰在IC中消失，表明封装后MLT非晶化。DSC显示IC中MLT熔融峰（118.3 °C）消失，表明成功封装和非晶化。TGA显示IC分解温度（DTG峰358.3 °C）高于游离MLT（292.1 °C），表明热稳定性增强。综上，NMR和FTIR表明MLT与M-β-CD间存在非共价相互作用，SEM、PXRD、DSC和TGA提供IC形成的补充证据。
3.3 IC的体外释放：在pH 5.5和7.4条件下评估IC的体外释放行为，120 min时MLT累积释放率分别为95.61 ± 2.23%和87.81 ± 0.92%，表明两种pH条件下MLT均能有效释放。但研究人员指出这些体外结果反映的是受控实验条件下的释放行为，不能直接证明植物组织内MLT摄取或递送的增强。
3.4 拟南芥种子引发对萌发和幼苗长度的影响：MLT、M-β-CD和IC对萌发率无显著影响，但种子引发显著增加幼苗长度，MLT和M-β-CD的幼苗长度显著优于IC。
3.5 MLT、M-β-CD和IC对拟南芥幼苗在盐胁迫和渗透胁迫下的效应：正常条件下，MLT显著增加鲜重、干重和色素含量，IC表现相同趋势且色素含量显著优于MLT，M-β-CD对生物量无显著影响但显著增加色素含量。100 mM NaCl下，所有处理均显著提高莲座直径和色素含量，鲜重和干重无显著变化，MLT处理的Chl a、Chl b和类胡萝卜素显著高于M-β-CD和IC。150 mM NaCl下，MLT未能诱导任何正面效应（幼苗漂白），而M-β-CD和IC处理显著增加莲座直径、鲜重、干重和色素含量，IC在色素含量方面显著优于M-β-CD，表明M-β-CD作为独立保护剂缓解盐胁迫的潜力。10% PEG下，所有处理表现相似，均改善植物生长和色素含量，莲座直径、鲜重和干重显著高于未处理幼苗。叶绿素荧光成像显示，正常条件下MLT处理显著增强qP_Lss和Rfd_Lss，M-β-CD和IC处理显著降低NPQ_Lss、qN_Lss和Rfd_Lss；100 mM NaCl下各处理NPQ_Lss、qN_Lss和Rfd_Lss显著降低；150 mM NaCl下对照和MLT处理幼苗完全漂白无法记录荧光参数，而M-β-CD和IC处理幼苗保留叶绿素并可记录参数；10% PEG下IC处理Fv/Fm_Lss和QY_Lss显著降低，NPQ_Lss显著升高，表明植物激活光保护热耗散机制以保护PSII免受过量激发能损伤。
3.6 MLT、M-β-CD和IC对印度缬草在干旱胁迫（DS）和洪涝胁迫（FS）下的效应：DS和FS显著影响植物生长，导致植株形态变小、叶片变小。快速叶绿素荧光分析显示IC处理植株在DS和FS下具有更好的O、K、J、I和P值，表明其光合系统受胁迫影响最小并进行修复维护。DS和FS下对照植株PI和Fv/Fm显著降低，而IC处理植株PI无显著降低，FS下PI值显著较高，表明PSII功能更好、胁迫保护更强。DS下M-β-CD处理Fv/Fm显著降低，FS下显著升高。DS和FS显著降低地上和地下部分鲜重和干重，FS下MLT和IC处理显著增加地上鲜重，所有处理显著增强地上干重，IC处理地上干重最高。正常条件下MLT处理显著降低Chl a、总Chl和类胡萝卜素含量，而M-β-CD和IC处理显著增加色素含量，表明在印度缬草色素生产中的协同效应。DS和FS显著降低色素含量，而各处理均缓解此效应，FS下IC处理显著增加色素含量。所有条件下各处理Chl a/b比值显著降低，IC处理在正常和胁迫条件下比值最低，反映植物适应策略。FS下对照植株叶片产生红色素，MLT和M-β-CD处理花青素含量显著增加，而IC处理花青素含量较对照降低，表明IC处理植株经历的胁迫程度较低。
3.7 MLT、M-β-CD和IC对印度缬草在DS和FS下次生代谢物的影响：分析了羟基缬草烯酸、乙酰氧基缬草烯酸、醋缬草三酯、缬草烯酸和缬草三酯，但仅缬草三酯、乙酰氧基缬草烯酸和醋缬草三酯检测到可定量水平。地下部分中，DS和FS导致缬草三酯积累显著高于正常条件；正常条件下MLT和M-β-CD显著降低缬草三酯水平而IC显著增加；DS下IC处理缬草三酯水平显著较高；FS下MLT和M-β-CD显著增加缬草三酯积累而IC降低。地上部分中，正常和DS条件下所有处理显著降低缬草三酯水平，表明IC的双重作用依赖于植物部位。乙酰氧基缬草烯酸和醋缬草三酯仅在地下部分定量。DS下MLT和IC处理乙酰氧基缬草烯酸积累增加；FS下MLT显著降低而其M-β-CD显著增加。醋缬草三酯仅在DS下对照植株中检测到；FS下MLT和M-β-CD显著增强醋缬草三酯积累而IC无显著变化。这些发现表明IC在不同胁迫源下遵循不同的次生代谢物介导保护机制。
3.8 印度缬草环烯醚萜生物合成途径基因表达分析：分析了7个关键基因GES、10HGO、G10H、IS、7DLS、7DLGT和DL7H的表达。正常条件下M-β-CD处理GES表达显著升高；FS下所有处理GES表达显著增加；DS下GES表达无显著变化。正常条件下所有处理10HGO表达显著降低；DS下对照降低而IC处理最高；FS下各处理无显著变化。正常条件下所有处理G10H表达增加；DS下MLT和IC处理G10H显著增加；FS下无显著变化。正常条件下所有处理7DLGT表达增加，MLT最高；DS下IC处理7DLGT表达最高；FS下M-β-CD和IC显著降低7DLGT表达。正常条件下MLT处理IS表达显著增加；DS下IC处理IS表达显著增加；FS下无显著变化。正常条件下MLT处理DL7H表达显著增加；DS和FS下IC处理DL7H表达显著较高。正常条件下MLT和IC处理7DLS表达显著增加；DS下IC处理7DLS表达显著增加；FS下MLT处理7DLS表达显著降低。基因表达谱与次生代谢物水平在不同胁迫条件和处理下呈现复杂关系，转录本丰度 alone 可能不能决定最终代谢物水平，暗示环烯醚萜生物合成其他途径基因的可能作用。
3.9 Pearson相关分析：拟南芥中鲜重与莲座直径、干重、Chl a/b比值和类胡萝卜素显著正相关，表明光合作用与生物量积累相互关联；QY_max和Fv/Fm_Lss与色素显著正相关，表明光合色素较高的植物具有更大更功能性的PSII；qP_Lss和qL_Lss显著正相关；Rfd_Lss与qN_Lss和NPQ_Lss显著正相关，表明高实际光合速率与高热耗散共存。印度缬草中O、J、I、P参数与Chl a、总Chl、类胡萝卜素、NPQ_Lss、qN_Lss和Rfd_Lss显著正相关；PI与地上鲜重、地下鲜重、地上干重、Chl a/b比值、QY_max、地下乙酰氧基缬草烯酸正相关，与地上缬草三酯负相关，表明PI作为植物性能的多参数指标；地上缬草三酯与PI、QY_max和地上鲜重显著负相关，表明地上缬草三酯积累较低时光合效率和叶部生长更好；花青素含量与Fv/Fm_Lss显著负相关，与J、I、P和Chl b显著正相关，表明花青素积累作为胁迫标记。
讨论部分总结：本研究通过相溶解度研究筛选出M-β-CD作为MLT的最佳包合主体，成功制备了1:1主客体包合物，多种表征手段共同证实了IC的形成。体外释放研究表明IC在两种pH条件下均能有效释放MLT。生物学功效评估表明，IC在拟南芥盐胁迫和渗透胁迫以及印度缬草干旱和洪涝胁迫下均持续优于游离MLT，帮助植物维持生长、色素含量和光合效率。值得注意的是，M-β-CD表现出超越载体功能的保护效应，凸显其作为植物胁迫耐受性独立调节剂的潜力。在印度缬草中，IC支持生物活性化合物积累和有益基因表达模式的维持。研究人员指出，基因表达与次生代谢物水平之间的关系复杂，转录本丰度 alone 可能不能决定最终代谢物水平，需要进一步研究组织特异性基因表达、代谢物运输和酶活性以阐明环烯醚萜代谢在印度缬草胁迫适应中的作用。此外，基于M-β-CD的络合为农业中MLT递送提供了潜在实用且经济有效的方法，但其大规模应用的经济可行性尚需进一步验证。
研究结论翻译：本研究证实，将MLT封装于M-β-CD中可改善其溶解性、稳定性和对植物一系列非生物胁迫的保护功效。IC持续优于游离MLT，帮助拟南芥和印度缬草在盐渍、干旱和洪涝等挑战性条件下维持生长、色素含量和光合效率。此外，IC支持印度缬草中生物活性化合物积累和有益基因表达模式的维持。值得注意的是，M-β-CD表现出超越载体功能的保护效应，凸显其作为植物胁迫耐受性独立调节剂的潜力。总体而言，这些发现凸显MLT/M-β-CD包合物（IC）作为增强植物适应性和维持气候变化下药用作物生产力的有前景策略，为气候智能型和可持续农业提供了多功能平台。此外，基于M-β-CD的络合为农业中MLT递送提供了潜在实用且经济有效的方法，尽管其大规模应用的经济可行性尚需进一步验证。
