克隆树频率分析揭示亲和力决定因素并实现抗体先导优化

《mAbs》：Clonal tree frequency analysis reveals affinity determinants and enables antibody lead optimization

　　

治疗性单克隆抗体（mAbs）发现中的核心挑战在于理解克隆家族内抗体亲和力的序列决定因素。本研究将氨基酸频率分析应用于抗ST2单克隆抗体的大型系统发育克隆树，其中V(D)J重排恒定而仅体细胞高频突变（SHM）可变。研究人员鉴定出重链中的M33I和L100I为关键亲和力调控突变，并经AlphaFold2结构建模和分子动力学自由能分解所证实。I33/I100基因型预测可显著改善对IL-33诱导的IL-6释放的功能性中和，并与更高的转录组亲和力评分（Hiscore）相关。对三种低亲和力亲本抗体的前瞻性突变改造实现了高达10倍的亲和力提升，建立了一套整合序列统计学、结构建模、转录组学和分子动力学（MD）模拟的工作流程，用于合理的先导抗体优化。

研究背景：治疗性单克隆抗体（mAbs）的发现与优化需要能够高效遍历巨大序列空间、快速鉴定高亲和力且具备所需功能特性的候选分子的策略。在生发中心（GCs）中，B细胞经历体细胞高频突变（SHM）与抗原驱动选择的迭代循环，产生亲和力逐步提高的克隆家族。单细胞技术与高通量B细胞受体（BCR）测序的进步使得从免疫动物中回收数千条抗体序列成为可能，结合亲和力测定，为多克隆反应的序列-亲和力景观提供了前所未有的洞察。研究人员此前整合单细胞基因表达（GEX）与BCR谱分析，推导出预测亚纳摩尔亲和力的转录组评分（Hiscore）。ST2（IL1RL1）是白细胞介素-33（IL-33）的受体，IL-33/ST2轴驱动2型炎症，与哮喘、特应性皮炎、心力衰竭等疾病相关，阻断该相互作用是经验证的治疗策略。尽管已有大型抗体数据集，将序列变异与亲和力的结构和生物物理决定因素相关联仍具挑战性。X射线晶体学和冷冻电镜等高分辨率方法资源密集、通量低且需要专门基础设施。SHM引入广泛的氨基酸变异，但仅凭突变计数难以预测亲和力。更具信息量的是鉴定克隆树中在高亲和力抗体中富集的突变，此时V(D)J框架恒定而仅SHM模式变化。本研究呈现了一种整合方法，结合大型克隆树（n=211条抗体）的SHM频率分析与AlphaFold2结构预测及基于MD的结合自由能分析，鉴定出重链第33和100位为关键亲和力决定因素，并证明在这些位点进行靶向突变可改善较弱抗体的亲和力和功能，提供了从序列统计学走向先导优化的实用路径。

研究人员开展的研究：研究人员对来自Chirichella等人抗ST2单细胞数据集的Tree15（最大的系统发育克隆树，基于IGHV1-15共享V基因使用和SHM积累模式聚类）进行了氨基酸频率分析，抗体按亲和力分类为HIGH（KD<10^-9 M）、MID（10^-9 M≤KD≤10^-8 M）或LOW（KD>10^-8 M）。由于该谱系中V(D)J重排恒定，亲和力和功能差异可完全归因于SHM。研究人员对全部亲和力类别进行了氨基酸频率分析和中和试验，评分在HIGH类别中相对于MID和LOW类别显著富集或耗竭、或在HIGH中独特呈现的特定氨基酸替换位点。最突出的发现是重链可变域第33位（M33I）和第100位（L100I）异亮氨酸的同时强烈富集，对应于含最多HIGH抗体的Tree15分支。携带I33/I100基因型的抗体在HIGH亲和力克隆中显著过-represented，而M33/L100为祖先状态主要见于LOW亲和力抗体。其他与高亲和力相关的突变包括第56位（G56D）、103位（G103D/103N）、110位（Y110H）、73位（K73T）、17位（V17L）、37位（K37R）和81位（E81A），提供了候选亲和力增强突变的排名列表。以IL-6释放为指标的中和试验进一步表征了与亲和力和功能均相关的SHM，M33I和L100I与两者均相关。为实验验证AlphaFold2预测的结合模型，研究人员使用生物层干涉术（BLI）测试了抗体与一系列截短ST2抗原的结合，截短体包括ST2 1–301（全长）、ST2 1–185、ST2 186–301和ST2 1–88。测试的Tree15抗体（ST2_43、ST2_47）结合含N端的构建体，而不结合C端片段ST2 186–301，证实结合表位位于N端，尤其是ST2前88个残基内，涵盖AlphaFold2预测为界面的环21–28和72–77。为获得亲和力驱动突变的机制性洞察，研究人员对24个代表性抗体-ST2复合物进行了原子级MD模拟，按亲和力类别和基因型分层，每个复合物以60 ns时间尺度三重重复模拟，轨迹用于分子力学/广义Born表面积（MM/GBSA）自由能结合分析。为前瞻性验证SHM频率分析用于合理先导优化的效用，研究人员将MD和频率分析鉴定的M33I、L100I和K37R突变引入三种低亲和力亲本抗体ST2_113、ST2_120和ST2_146。为研究Tree15内亲和力差异是否转化为差异功能活性，研究人员实施了基于内皮细胞（HUVECs）的细胞试验，其中IL-6释放与中和能力成反比。最后使用基于GEX的Hiscore验证Tree15抗体可按亲和力和突变组分层。

主要关键技术方法：研究使用Chirichella等人（Cell Systems, 2026）抗ST2单细胞数据集，抗原阳性小鼠B细胞分离自ST2免疫的CD1小鼠，经10x Genomics Chromium系统（5' GEM；配对GEX+VDJ）处理，BCR序列用MiXCR（v4.x）分析生成基于SHM模式的克隆型系统发育树。Fab和ST2-Fab复合物模型由AlphaFold2-Multimer（v2.3.2）生成。MD模拟使用AMBER24及ff19SB蛋白力场、tip3p水模型，每个复合物60 ns三重重复，自由能结合分析使用MMPBSA.py进行MM/GBSA计算及逐残基分解。抗体-抗原结合动力学在Octet RED仪器上以BLI测定。HUVEC细胞用于IL-33诱导IL-6释放中和试验。

研究结果：

SHM频率分析鉴定亲和力相关突变并验证保守N端结合模型：对Tree15的SHM频率分析鉴定出M33I和L100I为最突出的同时富集突变，携带I33/I100基因型的抗体在HIGH亲和力克隆中显著过-represented。BLI截短抗原结合实验证实Tree15抗体结合表位位于ST2 N端前88个残基内，与AlphaFold2预测的界面环一致，支持所有Tree15抗体在抗原识别模式上结构等效、SHM频率分析可适用于该家族的前提。

模拟的逐残基能量分解分析鉴定关键亲和力驱动区域：MD模拟显示HIGH和MID亲和力复合物比LOW具有更有利的ΔG值。逐残基分解鉴定出CDRH1、CDRH2、CDRH3和CDRL1四个主要抗体热点区域，其中I100（CDRH3）和D51（CDRH2）贡献最大个体能量值。ST2 N端鉴定出两个主要受体结合热点，贡献最大的四个ST2残基为R78、K23、F76和R20。CDRH3和ST2热点1被鉴定为亲和力关键决定因素，在HIGH和MID中能量显著低于LOW。第100位是分析中唯一显示从低到中到高逐步降低平均残基能量的残基。CDRH3和ST2热点1能量评分组合可预测亲和力，应用任意截断值（ΔG<-27 kcal/mol）可仅富集中和高亲和力抗体。比较I33/I100与M33/L100复合物鉴定CDRH3和CDRH1为关键亲和力驱动区域，组合能量评分（截断值-15 kcal/mol）可 largely 富集高亲和力抗体。

利用频率分析突变进行前瞻性先导优化及Tree15内功能验证：在ST2_146（亲本KD=1.05×10^-8 M，三位点均为不利残基M33/K37/L100）中，M33I和L100I同时引入（MCPP10923）将KD降至3.17×10^-9 M（3.3倍改善），三联组合M33I+L100I+K37R（MCPP10924）使结合接近亚纳摩尔范围，KD为1.03×10^-9 M，较亲本改善10.2倍。在已携带一个或两个有利残基的序列背景中也生成了变体：ST2_113（已携带I33）中L100I单独引入（MCPP10925）KD降至4.01×10^-9 M（2.2倍），L100I+K37R组合（MCPP10926）KD为3.36×10^-9 M（2.6倍）；ST2_120（携带I100但保留M33）中M33I单独引入（MCPP10921）产生 modest 变化（KD=8.14×10^-9 M；1.2倍），加入K37R（MCPP10922）无进一步获益。这些数据表明计算鉴定的突变可在克隆家族内不同序列背景间转移，渐进增强与M33I、L100I和K37R分别通过CDRH1、CDRH3和相邻框架区独立贡献结合界面的加性模型一致。按亲和力类别分层时，HIGH亲和力抗体对IL-33诱导的IL-6释放抑制显著强于MID+LOW组合；按基因型分层时，携带I33+I100的抗体IL-6抑制显著强于M33+L100。Hiscore验证显示HIGH/MID抗体Hiscore显著高于LOW，I33/I100抗体Hiscore显著高于M33/L100克隆及其他SHM组合，M33/L100与其他组合间无差异，提示Hiscore可作为亲和力替代指标用于在系统发育树中鉴定有利SHM组合。

讨论部分总结：尽管SHM驱动抗体亲和力成熟，总突变数不一定与更高亲和力相关。本研究表明SHM频率分析在V(D)J重排恒定的单一大型克隆树中能更好地预测亲和力和功能特性，最频繁的突变为最高亲和力抗体所必需。这些发现经AlphaFold2结构建模、MD自由能分解、细胞试验和前瞻性突变改造独立验证，提供了合理抗体先导优化的稳健新框架。通过Hiscore整合基因表达数据也鉴定出相同突变（I33/I100）为关键驱动因素，当克隆树缺乏亲和力注释时Hiscore可作为SHM频率分析前的替代先验。与以往聚焦单谱系进化、批量功能终点或依赖噬菌体/酵母展示经验选择的研究不同，本方法利用单一系统发育树内的自然进化历史，避免了对先前结构数据的需求，并整合AI预测结构上的MD模拟将序列统计学与原子级洞察相关联。与体外筛选方法相比，该策略固有地受限于特定克隆谱系的序列空间，但能高效鉴定自然谱系内的亲和力增强突变。SHM频率分析与MD在重链第33和100位的汇聚具有明确结构基础：第33位位于CDRH1区域不直接接触ST2，但M33I替换与 putative 局部框架重排一致，使I33抗体中E32与ST2 T75间形成氢键；第100位位于CDRH3，L100I替换使侧链重新定位，实现芳香堆积并与ST2 R20形成额外氢键，可能解释通过更紧密界面堆积和额外稳定相互作用获得的亲和力增益。K37R与M33I/L100I的加性效应提示第37位虽在界面外远端框架区，可能通过间接结构或动力学效应独立贡献结合。功能上I33/I100基因型在细胞试验中显示增强的IL-33中和，表明结构改善转化为体外生物活性增加。尽管前瞻性突变改造验证了M33I、L100I和K37R，效应大小在亲本抗体间有差异（ST2_120中M33I单独无改善），提示背景依赖性。MD模拟依赖AlphaFold2预测而非实验测定结构，AlphaFold2方法最好视为生成结构假设而非确定性原子分辨率描述，截短抗原BLI实验部分支持了结合模型。本研究基于单一特定V基因和抗原定义的克隆树，需扩展到更多克隆树、V基因和抗原以确立其作为先导优化策略的普遍适用性。

研究结论翻译：在克隆受控背景下，SHM驱动的亲和力增强特别是通过I33和I100，直接转化为改善的功能性中和，提示频率分析和MD模拟鉴定的亲和力决定因素具有生物学和治疗相关性。本研究展示SHM频率分析在V(D)J重排恒定的单一大型克隆树中能更好地预测亲和力和功能特性，最频繁的突变为最高亲和力抗体所必需，这些发现经AlphaFold2结构建模、MD自由能分解、细胞试验和前瞻性突变改造独立验证。序列统计学、结构建模、物理模拟和生物学验证的汇聚为合理抗体先导优化提供了稳健且新颖的框架，各方法可独立或组合使用。通过Hiscore整合基因表达数据也鉴定出相同突变（I33/I100）为关键驱动因素，当克隆树缺乏亲和力注释时Hiscore可作为SHM频率分析前的替代先验。