佛吉草（Monarda didyma）首个完整叶绿体基因组的结构表征与系统发育地位解析

《Mitochondrial DNA Part B》：Structural characterization and phylogenetic analysis of the chloroplast genome of Monarda didyma (Lamiaceae)

　　

佛吉草（Monarda didyma）是一种原产于北美东部的芳香草本植物（aromatic herb），具有生态、药用和观赏价值，但其叶绿体基因组（chloroplast genome）尚未被表征。研究人员利用二代测序数据（next-generation sequencing data）组装了其完整叶绿体基因组（151,812 bp）。该基因组呈现典型的四分结构（quadripartite structure）（LSC：83,025 bp；SSC：17,663 bp；IRs：25,562 bp each），包含132个基因（87个蛋白编码基因（protein-coding genes），37个转运RNA（transfer RNA, tRNA）基因，8个核糖体RNA（ribosomal RNA, rRNA）基因），GC含量（GC content）为37.82%。系统发育基因组学分析（phylogenomic analysis）解析出M. didyma与Pycnanthemum tenuifolium构成完全支持的姐妹群（sister clade）（BS = 100%）。该基因组为Monarda及相关属的物种鉴定（species identification）和系统发育研究（phylogenetic studies）提供了资源。

佛吉草（Monarda didyma Linnaeus (1753)）是唇形科（Lamiaceae）多年生草本，原产于北美东部，兼具生态、药用及观赏价值，其精油富含单萜类成分，具有抗氧化、抗炎及抗菌活性。尽管唇形科叶绿体基因组在Teucrium、Mentha及Salvia等属中已被广泛表征，证实质体基因组（plastome）可作为该科系统发育研究的有效标记，但取样长期偏向上述类群。目前NCBI仅收录Monarda属的ITS、matK及rbcL等少数基因序列，尚无完整叶绿体基因组报道；因此，Monarda与Pycnanthemum、Clinopodium的系统发育关系未经基因组尺度检验。同时，广义黄荆属（Clinopodium sensu lato）已被证实为非单系（non-monophyletic），其属级分类界限（circumscription）因核-质冲突（nuclear-plastid conflict）而悬而未决。鉴于此，研究人员开展了本项研究，旨在组装并注释M. didyma的首个完整叶绿体基因组，解析其结构特征与系统发育地位，为该属及相关类群提供基因组资源。

研究人员利用高通量测序技术（high-throughput sequencing）组装了M. didyma的完整叶绿体基因组（登录号PX394257.1），系统分析了基因结构、密码子使用偏好及序列多态性，并基于72个共有蛋白编码基因（protein-coding genes, PCGs）重建了最大似然系统发育树（maximum likelihood tree）。研究得出结论：M. didyma与细叶总序草（Pycnanthemum tenuifolium）以100%自举支持率（bootstrap support, BS）构成姐妹群（sister clade），且嵌套于广义黄荆属内部，为Monarda与Pycnanthemum的密切关系提供了首个基因组尺度证据，同时揭示了广义黄荆属的并系（paraphyletic）性质。

本研究的植物材料采集自中国山东省菏泽市牡丹区（Peony District, Heze City, Shandong Province, China；115.45615°E, 35.27039°N）的一个栽培居群，经Liqiang Wang鉴定，凭证标本（HZU-2025-0804）保存于菏泽大学（Heze University）标本馆。研究人员利用DNBSEQ平台完成150 bp双端（paired-end）测序，经Trimmomatic过滤原始reads后，采用GetOrganelle进行从头组装（de novo assembly），使用CPGAVAS2进行基因组注释并经Apollo手动校正，最终通过CPGview实现可视化。在系统发育重建中，研究人员以Ajuga forrestii和Ajuga bracteosa作为外类群（outgroup），提取24个近缘种及2个外类群的72个共有蛋白编码基因，经MAFFT比对后串联（concatenated），采用IQ-TREE在TVM+F+I+R5模型下构建最大似然树，并进行1000次重复检验。此外，研究运用PhyloSuite计算相对同义密码子使用度（Relative Synonymous Codon Usage, RSCU），利用CPStools评估核苷酸多样性（nucleotide diversity, Pi）。

基因组组装与结构注释

研究人员获得了一条大小为151,812 bp的完整环状叶绿体基因组，呈现典型的四分结构（quadripartite structure），由大单拷贝区（Large Single Copy, LSC）、小单拷贝区（Small Single Copy, SSC）和两段反向重复区（Inverted Repeat, IR）组成。该基因组共预测132个基因，包括87个蛋白编码基因、37个转运RNA（transfer RNA, tRNA）基因及8个核糖体RNA（ribosomal RNA, rRNA）基因。IR区注释到7个独特蛋白编码基因（rpl₂、rpl₂₃、ycf₂、ycf₁₅、ndhB、rps₇及rps₁₂）、6个独特转运RNA基因及4个独特核糖体基因（rrn_16S、rrn_23S、rrn_4.5S及rrn_5S）。基因结构分析显示，9个蛋白编码基因（rps₁₆、atpF、rpoC₁、petB、petD、rpl₁₆、rpl₂、ndhA及ndhB）各含一个内含子（intron），3个（clpP、rps₁₂及ycf₃）含两个内含子，rps₁₂被鉴定为反式剪接（trans-splicing）基因，另有6个转运RNA基因（trnK-UUU、trnG-UCC、trnL-UAA、trnV-UAC、trnI-GAU及trnA-UGC）含有内含子。全基因组GC含量为37.82%，其中IR区最高（43.05%），SSC区最低（31.73%），LSC区为35.9%。

系统发育重建

基于完整叶绿体基因组构建的最大似然树显示，M. didyma与细叶总序草以100%自举支持率构成姐妹群，并嵌套于广义黄荆属内部，而所有Clinopodium物种与该分支共同构成单系群（monophyletic group）。核苷酸多样性分析在Clinopodium类群中筛选出trnT-GGU、ycf₁及ndhF为变异程度最高的基因，psbI–trnS-GCU、trnH-GUG–psbA及ccsA–ndhD为变异程度最高的基因间隔区（intergenic regions），提示其具有作为DNA条形码（DNA barcodes）的潜力。

RSCU与Pi分析

相对同义密码子使用度分析表明，M. didyma叶绿体基因组表现出对A/U结尾密码子的强烈偏好，如亮氨酸（Leu）UUA和精氨酸（Arg）AGA的使用度均不低于1.82，而G/C结尾密码子使用频率较低，反映出典型的陆生植物叶绿体基因组密码子使用特征。

本研究首次报道了M. didyma的完整叶绿体基因组，证实其具备陆生植物叶绿体基因组的典型特征。系统发育基因组学（phylogenomic）分析强有力地支持M. didyma与细叶总序草（Pycnanthemum tenuifolium）的姐妹群关系，与既往基于ITS序列的研究结论一致。然而，该姐妹群深嵌于广义黄荆属内部，与C. chinense及C. vulgare subsp. vulgare关系尤为密切，这意味着若将Monarda与Pycnanthemum维持为独立属，广义黄荆属呈并系（paraphyletic）分布。研究人员指出，既往基于叶绿体trnK内含子、trnL-F及核基因ITS的研究已表明广义黄荆属是一个高度不自然的集合，其中混杂了来自20余个属的物种；本研究基于完整质体基因组数据提供了独立的基因组尺度证据，进一步强化了上述结论。未来研究需扩大该分支的物种取样，并整合形态学与多基因座分子数据，以重新评估这一复杂类群的属级界定。

研究人员总结认为，本研究成功组装了M. didyma的首个完整叶绿体基因组，系统发育分析证实M. didyma与细叶总序草（Pycnanthemum tenuifolium）构成高度支持的姐妹群（BS = 100%），二者共同嵌套于广义黄荆属（Clinopodium sensu lato）内部，证实广义黄荆属为并系类群，其属级分类界限亟待通过更多取样及多源数据加以修订。