细胞壁信号感受器调控少孢节丛孢（Arthrobotrys oligospora）的细胞壁完整性、产孢、捕器形成与次级代谢

《Mycology》：Cell wall signal sensors regulate cell wall integrity, conidiation, trap formation, and secondary metabolism in Arthrobotrys oligospora

　　

细胞壁信号感受器（CWSSs）是细胞壁完整性（CWI）信号通路的关键上游调控因子；CWI通路中的大多数基因对丝状真菌的细胞壁结构与胁迫响应至关重要。捕线虫（NT）真菌在感知线虫相关环境信号后，可从腐生向寄生发生特化的发育转变，而CWSSs在此过程中的功能仍 largely 未被阐明。本研究对NT真菌少孢节丛孢（Arthrobotrys oligospora）中四个WSC蛋白（AoWsc1、AoWsc2、AoWsc3和AoWsc4）的作用及其潜在调控网络进行了表征，揭示了它们在WSC介导的细胞表面感知捕器发育中的关键作用。wsc基因的缺失影响了细胞壁组分（几丁质和葡聚糖）、结构、胁迫响应、产孢、捕器形成及捕食线虫效率。此外，四个wsc基因参与自噬、内吞及多种代谢与细胞过程。本研究凸显了四个CWSSs在少孢节丛孢中的关键作用，为CWI通路如何协调NT真菌的细胞壁结构、无性发育与捕器形成提供了新见解。

研究背景与问题：捕线虫（NT）真菌是自然生态系统中的重要类群，其菌丝可分化为特化捕器（如收缩环、黏性球、黏性网）以捕获并杀死线虫，从而调控线虫种群动态。少孢节丛孢（Arthrobotrys oligospora）是广泛分布的NT真菌，通过形成黏性网捕获线虫并分泌胞外酶侵染消化。基因组与蛋白质组分析表明，信号转导、细胞壁生物合成、过氧化物酶体形成、甘油合成、细胞分裂、细胞骨架形成、黏附与能量代谢等多种细胞过程影响捕器形成；G蛋白信号、促分裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号及cAMP依赖蛋白激酶（cAMP-PKA）通路对线虫感知与捕器形成不可或缺。细胞壁完整性（CWI）通路是真菌中广泛保守的MAPK级联，是细胞壁合成、完整性维持与致病性的主要调控途径；其组分包括细胞壁信号感受器（CWSSs）、鸟苷酸交换因子（GEF）Rom2、小GTP酶Rho1、蛋白激酶C Pkc1、MAPK模块级联及下游转录因子SBF（Swi4/Swi6）与Rlm1。酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）有五个CWSSs（Wsc1、Wsc2、Wsc3、Mid2、Mtl1），分属WSC蛋白与MID蛋白两个亚家族；WSC蛋白在稻瘟病菌（M. oryzae）的黏附、细胞壁结构与毒力调控中起重要作用，在粗糙脉孢菌（Neurospora crassa）中wsc1缺失影响细胞壁结构、无性发育与菌丝融合，在构巢曲霉（Aspergillus nidulans）中wscA与wscB缺失导致菌丝形态、产孢与细胞壁结构缺陷。在少孢节丛孢中，CWI通路下游组分AoBck1、AoMkk1、AoSlt2、AoRho2、AoPkc1、AoRlm1与AoSwi6已被证明调控菌丝生长、细胞壁合成、胁迫响应、产孢与捕器形成，但上游CWSSs在胞外信号感知中的功能仍 largely 未知。与多数腐生或病原真菌不同，NT真菌响应线虫相关环境线索时发生从营养菌丝到捕食性捕器的特化发育转变，捕器形成伴随细胞壁与细胞表面的广泛重塑，提示胞外信号感知与细胞壁调控在此过程中尤为重要。由于WSC蛋白是保守CWI通路的上游感受器，研究人员假设WSC蛋白可能参与线虫相关胞外线索的感知或整合，并将信号传递至CWI通路，从而协调NT真菌的细胞壁重塑与捕器形态发生；这一保守的细胞表面感知系统是否被功能性招募至NT真菌的特化捕食性发育尚不清楚。

研究开展与结论：研究人员以酿酒酵母为参照，通过同源序列比对在少孢节丛孢中鉴定出四个WSC同源蛋白（Wsc1、Wsc2、Wsc3、Wsc4），并通过基因敲除、表型表征与多组学分析系统研究了它们的作用与调控网络。研究证明这四个CWSSs是少孢节丛孢细胞壁结构、胁迫响应、产孢、捕器形成、自噬与内吞的关键调控因子，揭示了各WSC蛋白间共有与分化的作用。研究结果加深了对NT真菌CWI通路功能多样性的理解，并为探索CWI、次级代谢与膜运输系统间复杂调控网络建立了理论框架。

关键技术方法：通过同源序列比对鉴定目标蛋白，构建邻接法系统发育树（bootstrap 1000次重复），利用NCBI批量CD-search获取保守结构域并用TBtools可视化，以ExPASy pI/MW工具预测氨基酸长度、等电点（pI）与分子量（MW）。采用同源重组构建敲除载体，经PEG/CaCl₂介导转化少孢节丛孢原生质体，以PCR与实时定量PCR（RT-qPCR）验证转化子。表型分析包括菌丝生长与细胞壁组分（几丁质、葡聚糖）测定、胁迫响应相对生长抑制率（RGI）计算、产孢与孢子萌发统计、捕器形成与线虫捕食能力观察；以calcofluor white（CFW）、DAPI、MDC与FM4-64染色结合荧光显微镜观察菌丝形态、自噬体与内吞，并以透射电镜（TEM）观察超微结构。分子水平采用RNA提取与RT-qPCR（以β-微管蛋白基因为内参，2^?ΔΔCt法计算）、基于HPLC-MS的代谢组分析、基于Illumina NovaSeq X Plus平台的转录组测序（fastp、HISAT2、RSEM、DESeq2分析，差异表达基因DEGs标准为FDR < 0.05且|Log₂FC| ≥ 1，原始数据提交GEO登录号GSE346348），以及基于STRING（高置信度阈值0.7）与Cytoscape 3.9.1的蛋白互作网络构建和HADDOCK 2.4分子对接。所用菌株为少孢节丛孢野生型（WT）ATCC24927及其衍生突变体、酿酒酵母FY834、大肠杆菌DH5α，线虫为秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）N2株。统计采用GraphPad Prism 8.0的Student's t检验，显著性阈值p < 0.05，实验三次独立生物学与technical重复。

研究结果：

3.1 WSC家族蛋白的鉴定与系统发育分析：以酿酒酵母保守WSC结构域为参照鉴定出四个同源蛋白，分别含1036、1476、2153与401个氨基酸，预测MW为108.637、154.971、225.631与42.273 kDa，pI为3.91、5.6、4.79与6.7。系统发育分析显示AoWsc1与AoWsc4分属两个独立分支，AoWsc2与AoWsc3聚为同一分支；AoWsc1、AoWsc2、AoWsc4分别与NT真菌Dactylellina cionopaga、Dactylellina haptotyla、Arthrobotrys flagrans的同源物高度相似，AoWsc2与AoWsc3与Arthrobotrys flagrans、Neurospora crassa、Fusarium graminearum、Beauveria bassiana等同源物高度相似。四个蛋白除共有保守WSC结构域外各具独特结构域：AoWsc1含Trypan_PARP结构域，AoWsc2含Choice_anch_D结构域，AoWsc3含功能未知的DUF1573结构域；研究人员推测这与少孢节丛孢需检测更广泛外部信号（如线虫）以精确调控捕食信号有关。经PCR与RT-qPCR获得每个基因三个以上突变株。

3.2 Aowsc1、Aowsc2、Aowsc3与Aowsc4调控菌丝生长与发育：四个突变株在PDA、TYGA与TG培养基上的菌丝生长速率与形态与WT无显著差异；CFW与DAPI染色显示四个突变株菌丝细胞长度显著增加、每细胞核数显著减少，相同成像条件下细胞壁荧光强度明显弱于WT。进一步测定核心细胞壁组分，四个突变株的几丁质与葡聚糖含量较WT显著降低，提示这些基因缺失影响细胞壁结构。

3.3 Aowsc1、Aowsc2、Aowsc3与Aowsc4调控细胞壁结构与胁迫响应：四个突变株对SDS与刚果红呈现不同胁迫响应，ΔAowsc1对SDS不敏感，ΔAowsc2对0.01% SDS敏感，ΔAowsc3与ΔAowsc4对高浓度SDS（0.02%–0.03%）敏感，但四个突变株对刚果红抗性均显著增强（RGI值明显低于WT）。SDS为强阴离子表面活性剂，主要破坏细胞膜脂双层致胞内物泄漏；刚果红主要结合几丁质与葡聚糖，干扰多糖链正常组装并破坏细胞壁合成。TEM显示四个突变株细胞壁结构均出现不同程度异常，如质壁分离与细胞壁皱缩，异常结构比例显著升高。细胞壁合成相关基因chs-1、chs-2、gfpa、gls、glu、hex、trs的转录水平检测显示，chs-2、glu与hex在四个突变株中显著下调，trs显著上调；转录组聚类热图亦显示ΔAowsc2与ΔAowsc4中chs-2明显下调、trs显著上调。CWI通路在ΔAowsc2与ΔAowsc4转录组中显著富集，KEGG分析显示CWSSs响应细胞壁胁迫激活CWI通路并影响细胞壁重塑；聚类热图显示Aowsc2与Aowsc4缺失导致bem2、mkk2、rho1、bni1、rom2、pkc1等CWI通路基因表达显著下调。氧化与渗透胁迫实验显示，ΔAowsc1对H₂O₂不敏感，ΔAowsc2、ΔAowsc3、ΔAowsc4对H₂O₂敏感；ΔAowsc1与ΔAowsc4对menadione抗性增强（RGI明显降低），ΔAowsc2与ΔAowsc3对menadione敏感；ΔAowsc2、ΔAowsc3、ΔAowsc4对NaCl与低浓度山梨醇（0.25–0.5 mol/L）抗性增强，ΔAowsc1对这些渗透胁迫因子抗性降低。上述结果表明四个基因参与细胞壁结构与胁迫响应调控。

3.4 Aowsc1、Aowsc2、Aowsc3与Aowsc4为产孢与孢子萌发所必需：ΔAowsc2与ΔAowsc3分生孢子梗较少且稀疏，ΔAowsc1与ΔAowsc4分生孢子梗较密集；Aowsc2与Aowsc3破坏显著降低孢子产量，Aowsc1与Aowsc4缺失则提高孢子产量；ΔAowsc1、ΔAowsc2、ΔAowsc3在4–12 h孢子萌发率显著降低，ΔAowsc4萌发率高于WT。RT-qPCR与转录组分析显示，除fluG与veA外所有检测的产孢相关基因在ΔAowsc2与ΔAowsc3中显著下调，除velB与flbC外所有检测基因在ΔAowsc1与ΔAowsc4中显著上调；转录组聚类热图显示核心产孢相关基因abaA、brlA、wetA在ΔAowsc2中下调、在ΔAowsc4中上调。结果表明Aowsc2与Aowsc3在产孢中起关键作用，而Aowsc1与Aowsc4作为产孢的负调控因子。

3.5 Aowsc1、Aowsc2、Aowsc3与Aowsc4调控捕器形成、致病性与次级代谢：加入等量线虫诱导后12–48 h，四个突变株捕器数量显著低于WT，减少约50%，捕食线虫效率亦显著降低。TEM显示四个突变株捕器细胞中电子致密体（EDBs）丰度显著低于WT。代谢组分析显示ΔAowsc2与ΔAowsc4代谢谱与WT无显著差异，但聚类与火山分析检测到ΔAowsc2中327个下调、165个上调差异代谢物，ΔAowsc4中73个下调、123个上调差异代谢物。负离子通道（m/z = 139、393、429）检测显示ΔAowsc2与ΔAowsc4中arthrobotrisins含量高于WT，且arthrobotrisin相关AOL_s00215g基因簇中多数基因转录水平升高，表明Aowsc2与Aowsc4对arthrobotrisins生物合成起负调控作用。差异代谢物富集的前10条代谢通路在ΔAowsc2中为scopolin与esculin生物合成超通路、甲苯降解III、4-羟基苯甲酸生物合成超通路，在ΔAowsc4中为脂氧合酶超通路、芳香化合物降解与分支酸代谢。结果提示Aowsc2与Aowsc4参与调控捕器形成、线虫捕食、arthrobotrisin生物合成与次级代谢。

3.6 转录组分析揭示Aowsc2与Aowsc4的调控机制：对线虫诱导后的ΔAowsc2与ΔAowsc4菌丝进行转录组分析，质控显示各样本Q20与Q30分别高于98%与96%，GC含量48.12%–48.49%。与WT相比，ΔAowsc2与ΔAowsc4在0 h分别有75与79个上调、1768与118个下调DEGs，18 h分别有74与437个上调、121与176个下调DEGs；Venn分析显示WT、ΔAowsc2与ΔAowsc4间分别有56与25个共调控DEGs。KEGG分析显示ΔAowsc2中过氧化物酶体、淀粉与蔗糖代谢、代谢通路、次级代谢物生物合成、果糖与甘露糖代谢及内吞通路显著富集，ΔAowsc4中乙醛酸与二羧酸代谢、线粒体自噬、MAPK信号通路、次级代谢物生物合成与代谢通路显著富集。对捕器形成期特异DEGs（ΔAowsc2 139个、ΔAowsc4 588个）的GO富集分析显示，ΔAowsc2主要富集于膜锚定组分与四吡咯结合通路，ΔAowsc4主要富集于细胞氮代谢、大分子代谢与细胞质通路。对0 h特异DEGs（ΔAowsc2 1787个、ΔAowsc4 172个）的分析显示，Aowsc2缺失主要影响染色体组织、DNA复制、膜内在组分、细胞周期与蛋白酶体复合物过程，Aowsc4缺失主要影响脂肪酸生物合成、质膜与无机阴离子跨膜转运活性。上调DEGs在ΔAowsc2中主要富集于代谢通路、次级代谢物生物合成、脂肪酸代谢与过氧化物酶体，在ΔAowsc4中富集于过氧化物酶体、色氨酸代谢与代谢通路；下调DEGs在ΔAowsc2中显著富集于细胞周期、错配修复、DNA复制与核质运输，在ΔAowsc4中主要富集于糖酵解、次级代谢物生物合成、丙酮酸代谢与代谢通路。Aowsc2与Aowsc4对MAPK信号通路作用相反，该通路在ΔAowsc2中受抑制而在ΔAowsc4中激活。结果提示两者在整合全基因组转录重编程中作用不同。

3.7 Aowsc1、Aowsc2、Aowsc3与Aowsc4参与自噬与内吞：MDC染色显示四个突变株菌丝自噬体体积减小、数量增多，TEM显示突变株自噬体多于WT；转录组数据显示自噬相关基因atg1、atg8、atg9、atg17、atg13在ΔAowsc2与ΔAowsc4中上调，RT-qPCR验证显示这些基因在ΔAowsc2中亦上调，atg9、atg13、atg17在ΔAowsc4中上调，atg1与atg9在ΔAowsc1中上调，atg1、atg8、atg9在ΔAowsc3中上调。FM4-64染色显示加入染料7 min后突变株菌丝出现明显红色荧光，而WT仅见少量荧光；TEM显示四个突变株内吞明显而WT未见；内吞相关基因necap2、ucp3、end3、siw14在ΔAowsc2与ΔAowsc4中显著上调。结果表明四个基因参与自噬与内吞通路的调控。

3.8 Aowsc1、Aowsc2、Aowsc3与Aowsc4的蛋白调控网络：STRING预测显示AoWsc1主要与转录起始因子TFIID、SAGA乙酰转移酶复合物Spt3与Sgf73及若干假想蛋白互作，AoWsc3主要与外泌体复合物核心亚基Sec6、Sec10、Sec15、Rab家族蛋白Rab1、小单体GTP酶Rab7及若干假想蛋白互作，提示AoWsc1主要参与环境信号转导与特定基因转录激活，AoWsc3主要通过高尔基体-外泌体途径调控内膜系统膜运输。ΔAowsc2与ΔAowsc4转录组DEGs的蛋白互作网络预测显示AoWsc2与AoWsc4均与CWI通路蛋白Rom2存在潜在关联；分子对接显示AoWsc2、AoWsc4与AoRom2可能存在互作，HADDOCK2.4服务器给出的Z-score分别为?2.4与?1.0。预测调控网络中Rom2/Rho1进一步与自噬、细胞壁合成及囊泡运输相关蛋白Atg1、Atg8、Gls、End3、Necap2相连。研究人员指出WSC家族的蛋白互作分析主要基于STRING网站预测与分子对接，未在本研究中进行实验验证。

讨论与结论：CWI通路调控真菌适应性响应及细胞壁合成、降解与重塑等多种细胞功能。少孢节丛孢中CWI通路关键蛋白激酶Pkc1、MAPK级联组分Bck1、Mkk1、Slt2及下游转录因子Rlm1、Swi6已被证明为细胞壁结构、无性发育与捕器形成所必需；本研究考察了CWSSs的功能及上游CWI感受器是否将细胞表面信号与捕器形态发生功能性连接。结果显示四个Aowsc基因在细胞壁稳态与捕器形成中功能共享，而在产孢中作用不同，并参与自噬、内吞与次级代谢调控，支持WSC介导的细胞表面感知与保守CWI调控及少孢节丛孢特化捕食性发育相关联的假设。细胞壁是真菌抵御外界环境的第一道屏障，四个CWSSs均参与细胞壁稳态，其破坏导致细胞壁组成、结构与胁迫响应的协同改变；突变株虽几丁质与葡聚糖含量降低却对刚果红耐受性增强，研究人员推测组分降低可能部分解释刚果红抗性增强，但确切关系仍待确定。ΔAowsc2、ΔAowsc3、ΔAowsc4对NaCl与山梨醇渗透胁迫耐受性增强，研究人员推测可能反映对细胞壁结构缺陷的补偿性响应：受损细胞壁结构致胞内膨压显著升高，外源渗透胁迫剂可部分缓解该膨压，从而减轻缺陷细胞壁骨架所致的质壁分离压力；较低胞内膨压还可能促进突变株钠离子外排，改变离子平衡并影响细胞壁合成酶的反馈调控，进一步缓解缺陷细胞壁压力，此"挽救效应"强于渗透胁迫对生长的常规抑制效应，最终使突变株RGI值降低。在Trichoderma reesei中山梨醇被用作渗透稳定剂培养细胞壁脆弱的真菌；在酿酒酵母中HOG与CWI通路协同调控细胞壁重塑与胁迫响应，故ΔAowsc突变株渗透胁迫表型的改变可能源于膨压平衡与胁迫信号的补偿性调整而非简单的渗透抗性增减。与表型变化一致，ΔAowsc2与ΔAowsc4中若干细胞壁合成与重塑基因转录改变，几丁质与葡聚糖合成酶基因chs-2与glu表达降低，细胞壁重塑相关基因（如mih1、bem2、bni1、clb4）及CWI通路组分rom2、rho1、pkc1、mkk2、swi6变化，支持AoWsc2与AoWsc4对维持CWI通路与协调适应性细胞壁重塑至关重要，表明细胞壁在CWI通路受损时进化出复杂调控网络以响应外部刺激。CWI通路在无性发育多个阶段至关重要，调控丝状真菌细胞壁重塑；在烟曲霉（Aspergillus fumigatus）中产孢依赖分生孢子梗发育，其发育受多种蛋白协同调控并需细胞壁重塑以完成分生孢子梗的直立与成熟，pkcA、mpkA、rlmA缺失显著损害同步无性分化中的产孢量，RlmA直接调控产孢相关基因（flbB、flbC、brlA、abaA、rasB）与细胞壁重塑相关基因表达；在构巢曲霉中rlmA缺失影响brlA表达从而改变分生孢子梗形成；在少孢节丛孢中AorlmA缺失减少分生孢子梗数、孢子产量及核心产孢基因abaA转录。本研究中Aowsc1与Aowsc4缺失提高产孢能力，核心产孢相关基因brlA、abaA、wetA及fluG、veA、hyp1在ΔAowsc1与ΔAowsc4中显著上调；相反Aowsc2与Aowsc3降低产孢能力，brlA、abaA、wetA、fluG、velB、veA、hyp1在相应突变株中显著下调；而AorlmA表达在ΔAowsc2与ΔAowsc4中分别于0 h上调、18 h下调，研究人员提出AorlmA可能不通过brlA、abaA、wetA三个核心产孢基因直接调控少孢节丛孢分生孢子梗发育与无性产孢。细胞壁胁迫通过调控brlA表达阻碍构巢曲霉无性发育，BrlA为分生孢子梗早期发育的关键调控因子并激活分生孢子发生的中心调控途径；FluG是构巢曲霉产孢起始的重要激活因子，velvet复合物VelB/VeA/LaeA偶联光信号控制有性发育，fluG活性产生的产孢信号经多种光信号转导蛋白传至brlA并最终汇入中心调控级联。因此研究人员推测Aowsc1与Aowsc4在产孢中起关键正调控作用，而Aowsc2与Aowsc3通过调控fluG、velB、veA、brlA、abaA、wetA表达负调控该过程；但Aowsc1与Aowsc4、Aowsc2与Aowsc3在产孢中作用不同的原因及其是否受细胞壁胁迫调控仍需进一步研究，研究人员推测四个WSC蛋白对外部细胞壁胁迫的差异响应导致其对无性发育过程的不同影响。CWI通路是多种植物病原真菌侵染结构发育与致病性的关键介导者；少孢节丛孢捕器形成伴随大量细胞壁重塑，需特定区域细胞壁的局部降解、合成与重构。本研究中四个基因缺失显著降低捕器形成与线虫捕食，Aowsc2与Aowsc4缺失还导致CWI通路基因（如rho1、rom2、pkc1、mkk2、swi6）表达显著下调，提示细胞表面信号识别蛋白缺失损害CWI信号，阻碍捕器发育所需的精确细胞壁重塑，最终减少捕器形成；此外捕器形成起始需检测线虫信号，四个Wsc蛋白作为CWSSs可能参与细胞壁物理胁迫与外部环境线索（如线虫）的感知，其缺失削弱真菌对线虫信号的响应性从而阻碍捕器发育。在稻瘟病菌中Wsc1、Wsc2与Mid2在菌丝生长、产孢与胁迫响应中作用独立，但在附着胞形成与毒力中作用重叠；类似地四个ΔAowsc突变株在捕器形成与致病性上表型相似，提示这些蛋白在该过程中存在功能冗余并共同构成检测细胞壁与外部信号的信号网络，但其功能冗余仍需进一步研究确认。CWI通路在细胞壁生物合成中不仅激活细胞壁组装，还调控次级代谢物（如黑色素、真菌毒素与抗菌化合物）产生，赋予真菌结构完整性与环境竞争适应力，这些次级代谢物既是防御化合物也是侵染过程中的毒素；CWI通路核心组分突变导致次级代谢谱显著改变，如Alternaria alternata中AaRlmA正调控多种真菌毒素产生，ΔAaslt2突变株降低毒力与ACT毒素产生，灵芝（Ganoderma lucidum）中slt2破坏抑制CWI信号并显著降低羊毛甾醇与角鲨烯水平及灵芝酸总产量，Fusarium oxysporum中CWI级联组分bck1缺失显著消除伏马菌素B1产生，少孢节丛孢中AoRlmA对次级代谢至关重要。本研究中CWI上游CWSSs（Aowsc2与Aowsc4）亦为次级代谢所需，CWI通路可能对不同次级代谢物发挥正或负调控作用，如Alternaria alternata中RlmA缺失提高黑色素水平；本研究中Aowsc2与Aowsc4缺失上调AOL_s00215g基因簇中多数arthrobotrisin生物合成基因表达，ΔAowsc2与ΔAowsc4中arthrobotrisin水平高于WT，而少孢节丛孢中AoRlmA负调控arthrobotrisin生物合成；研究人员推测完整CWI信号通路可能与其他信号通路（如cAMP-PKA与MAPK）交叉对话，通过转录抑制因子负调控arthrobotrisin生物合成基因簇表达，当CWI组分缺失致CWI信号受损时该抑制解除，导致生物合成基因簇激活与arthrobotrisins积累。本研究中ΔAowsc2检测到327个下调、165个上调化合物，ΔAowsc4检测到73个下调、123个上调化合物，表明Wsc缺陷触发次级代谢显著变化，也提示Wsc2与Wsc4虽同属WSC家族但可能在CWI通路激活中作用不同；AoWsc2与AoWsc4可能存在部分功能冗余，AoWsc4的功能较AoWsc2更易被其他WSC成员（如AoWsc1与AoWsc3）补偿；但本研究未对AoWsc1与AoWsc3进行代谢组分析，未来应开展Wsc家族成员双敲除及AoWsc1与AoWsc3代谢组分析以验证该假设。自噬使细胞在胁迫条件下分解内部组分以进行大分子回收与能量产生；病原真菌中细胞壁是抵御外部胁迫的主要屏障，自噬在环境胁迫或病原侵染时参与蛋白、膜与细胞器的液泡周转。CWI通路与自噬的关联已在稻瘟病菌与酿酒酵母等多种真菌中报道：稻瘟病菌中Atg1与Atg11、Atg13、Atg17结合磷酸化Mkk1从而在侵染全过程维持CWI通路激活，Swe1通过磷酸化核心MAPK级联激酶Mps1（Slt2同源物）并与Atg17、Atg18互作正向调控自噬。本研究中四个基因缺失影响自噬，观察到自噬体体积减小与数量增加，五个自噬相关基因（atg1、atg8、atg9、atg17、atg13）在四个突变株中部分或完全上调，这种协同上调提示自噬通路从起始到自噬体形成在四个wsc基因缺失后被激活；但蛋白互作网络分析显示AoWsc2与AoWsc4通过Rom2与Rho1间接与自噬蛋白Atg1、Atg8互作而非直接互作，研究人员推测wsc基因缺失损害细胞壁结构与CWI，细胞因而增强自噬以回收受损组分，提供能量并应对胁迫响应。此外四个突变株较WT出现显著内吞，内吞相关基因（necap2、ucp3、end3、siw14）在ΔAowsc2与ΔAowsc4中显著上调；类似地AoWsc2与AoWsc4通过Rom2间接与内吞蛋白End3、Necap2互作。酿酒酵母中Wsc2与Wsc4利用不同内吞途径调控自身周转，这些蛋白积累于质膜，end3缺失时对细胞壁胁迫超敏；此外STRING预测显示AoWsc3与外泌体复合物核心蛋白Sec6、Sec10、Sec15、Rab家族蛋白Rab1及小单体GTP酶Rab7互作。自噬与内吞分别通过膜囊泡运输降解与回收胞内与胞外组分，越来越多证据表明两者功能相互依赖，其联合调控网络对细胞代谢与信号转导至关重要；因此研究人员推测wsc基因缺失所致的细胞壁结构受损通过受损细胞器、蛋白降解与质膜蛋白回收同时激活自噬与内吞通路，以维持膜质量、供能并响应细胞壁胁迫，提示这种系统性激活是对细胞壁结构损伤的适应性响应，并进一步揭示Wsc蛋白通过差异调控自噬与内吞等囊泡运输通路协调质膜组成稳态与细胞稳态的重要功能。研究局限性包括：因反复尝试仍未能成功扩增WSC蛋白全长编码序列，AoWsc蛋白与CWI通路组分的潜在关联主要来自网络预测，仅提供功能连接假设而非蛋白物理互作的直接证据，需酵母双杂交、免疫共沉淀与分裂荧光素酶互补等实验验证；仅选取ΔAowsc2与ΔAowsc4进行转录组与代谢组分析，二者因在细胞壁结构与捕器形成缺陷上相似而在产孢上作用相反被选为代表，但缺乏ΔAowsc1与ΔAowsc3的相应组学数据限制了对四个WSC蛋白功能分化的全面评估，故所述组学调控差异仅限于AoWsc2与AoWsc4相关响应而非整个WSC家族，未来需对ΔAowsc1与ΔAowsc3开展比较组学分析并结合组合遗传分析以进一步界定各WSC感受器共有与特异的调控功能。

结论翻译：本研究系统考察了NT真菌少孢节丛孢CWI通路上游细胞壁信号识别蛋白（AoWsc1、AoWsc2、AoWsc3与AoWsc4）的生物学作用与潜在调控网络，分析涵盖营养生长、细胞壁损伤、胁迫响应、产孢、捕器形成、次级代谢与膜运输。这些结果不仅加深了对NT真菌CWI通路功能多样性的理解，也为探索真菌中连接CWI、次级代谢与膜运输系统的复杂调控网络建立了理论框架。