AUREO1b作为三角褐指藻色素生物合成候选转录调控因子的功能解析

《Algal Research》：AUREOCHROME 1b is a candidate transcriptional regulator of pigment biosynthesis in Phaeodactylum tricornutum

　　

AUREOCHROME 1b是三角褐指藻（Phaeodactylum tricornutum）中色素生物合成的候选转录调控因子。PhaeoNet网络挖掘鉴定出AUREO1b和σ70.4为类异戊二烯（isoprenoid）候选转录因子（TFs）。研究人员在三角褐指藻中筛选了四个转录因子过表达株系。AUREO1b、HSF1和HSF3过表达可增加类胡萝卜素（carotenoid）和叶绿素（chlorophyll）含量。σ70.4过表达不改变色素水平。每个转录因子调控不同的色素生物合成和光合作用基因集。

研究背景：海洋微藻仅利用阳光和CO₂在海水中的生长能力使其成为具有可持续性潜力的生产平台。三角褐指藻（Phaeodactylum tricornutum）作为一种多功能模式硅藻，具有快速生长能力和不断扩展的分子工具，可用于萜类化合物（terpenoids）等高价值化合物的合成。萜类化合物来源于类异戊二烯（isoprenoids），由五碳异戊烯基二磷酸（IPP）单元构建而成，在初级代谢中发挥关键作用，包括维持膜完整性的甾醇（sterols）、参与光捕获和光保护及抵御活性氧的类胡萝卜素（carotenoids）以及传递电子的泛醌（ubiquinones）。硅藻通常具有两条类异戊二烯生物合成途径：质体中的甲基赤藓糖醇4-磷酸（MEP）途径和主要存在于胞质中的甲羟戊酸（MVA）途径。MEP途径中DXS和DXR催化前两步反应，通常被认为是限速步骤，IDI平衡IPP/DMAPP比例构成另一步限速步骤。提高萜类化合物产量的关键挑战在于细胞的稳态调控，通过转录因子（TFs）工程广泛重编程代谢可能释放更高的生产能力。研究人员在磷酸盐耗竭条件下对三角褐指藻类异戊二烯代谢的转录调控进行分析时，基于PhaeoNet共调控网络鉴定出可能参与MEP途径调控的候选转录因子，包括AUREOCHROME 1b（AUREO1b）和sigma因子70.4（σ70.4）。本研究对这些候选因子在硅藻过表达株系中进行功能表征，分析其表型和转录组，以揭示类异戊二烯代谢转录调控的新层面。

主要技术方法：研究采用PhaeoNet共表达网络分析鉴定候选转录因子；通过uLoop组装系统构建表观体（episome）载体，经细菌接合（bacterial conjugation）将表观体导入三角褐指藻（菌株CCMP632，CCAP 1055/1）；利用流式细胞术筛选转化株系；采用高效液相色谱（HPLC）进行色素提取和定量分析；通过RNA测序（RNA-seq）和实时定量PCR（RT-qPCR）分析基因表达；进行基因本体（GO）富集分析和系统发育分析。

研究结果：（1）基因编码的推定转录因子与类异戊二烯生物合成途径共调控：PhaeoNet数据集中MEP途径基因在lightsteelblue1模块中高度共调控，包括DXS、DXR、IDI、HDS和HDR等关键节点，三个转录因子AUREO1b、σ70.4和Phatr3_J50411与该模块共调控，为MEP途径调控的候选因子。研究人员构建了AUREO1b、σ70.4、HSF1和HSF3的过表达株系，其中HSF1和HSF3作为阳性对照并扩展转录组分析。（2）AUREO1b、HSF1和HSF3过表达增强色素积累而σ70.4无此效应：σ70.4-OE株系生长与对照相当，HSF1-OE和HSF3-OE株系生长适度降低，AUREO1b-OE株系生长最慢。培养8天后，AUREO1b、HSF1和HSF3过表达株系类胡萝卜素和叶绿素积累相当程度增加，σ70.4-OE株系无可检测变化。（3）AUREO1b、σ70.4、HSF1和HSF3过表达诱导色素和光合作用相关基因表达：RNA-seq分析鉴定出AUREO1b-OE中1411个、σ70.4-OE中803个、HSF1-OE中1694个、HSF3-OE中1059个差异表达基因（DEGs）。所有四个转录因子过表达株系均增加色素生物合成和色素结合复合体相关基因的表达，包括MEP途径组分、类胡萝卜素和叶绿素生物合成、光捕获复合体（LHCs）、光系统II（PSII）亚基及其他电子传递组分。AUREO1b-OE未差异调控MEP途径初始簇基因，σ70.4-OE仅上调MCT2。HSF3-OE特异性诱导DXS。AUREO1b和HSF1-OE均诱导PSY。所有株系上调LHC基因的不同亚群，σ70.4、HSF1和HSF3诱导LHCx1，AUREO1b未诱导；HSF1诱导LHCx4而AUREO1b特异性诱导LHCx3。叶绿素生物合成基因在所有过表达株系中广泛诱导但模式具转录因子特异性。AUREO1b株系中多个电子传递组分显著诱导。在Calvin-Benson循环中，AUREO1b和HSF3-OE上调G3P脱氢酶。（4）AUREO1b和HSF3在硅藻中保守而HSF1似为三角褐指藻特有：BLASTp分析鉴定出19个AUREO1b同源物和45个HSF3同源物，均存在于硅藻物种中，非硅藻谱系无命中；HSF1未检测到满足覆盖度阈值的同源物，似为三角褐指藻特有。

讨论与结论：本研究旨在鉴定协调三角褐指藻类异戊二烯生物合成的候选转录因子。通过整合共表达网络分析与转录因子列表，鉴定出三个可能影响类胡萝卜素生物合成的新候选因子。AUREO1b、HSF1和HSF3过表达驱动类胡萝卜素和叶绿素积累显著增加并显示相关基因上调，但亦显示生长减缓，其机制原因尚不清楚。σ70.4过表达尽管在转录组水平显示相似的色素和光合作用相关基因上调，但未能提高色素含量。RNA-seq分析证实所有四个转录因子增强关键类胡萝卜素和叶绿素生物合成及光捕获复合体基因表达，揭示共享的调控特征却产生不同表型。尽管通过转录因子与MEP途径关键酶的共调控发现具有目标表型的转录因子AUREO1b，但MEP途径基因表达未受这些共调控转录因子表达的显著影响，这可能表明存在尚未发现的调控MEP途径基因及AUREO1b和σ70.4表达的转录因子。在植物中MEP途径不仅受转录因子转录水平调控，还受酶降解的翻译后调控、代谢物变构反馈抑制或与胞质MVA途径的交叉对话间接调控。本研究在连续光照（90 μmol photons m^?2 s^?1）下进行，与先前HSF1和HSF3研究使用的16:8 h光暗周期50 μmol photons m^?2 s^?1不同，光照方案、质量和强度的差异可能解释HSF1和HSF3差异调控的色素生物合成基因集仅部分重叠。可变重复数特别是HSF3仅两个重复降低统计功效。每个转录因子仅表征一个代表性过表达株系。缺乏直接转录因子启动子结合试验（如ChIP-seq）无法确定直接靶标与间接下游效应。扩展至敲除株系将是检验AUREO1b是否为色素积累所必需的决定性测试。综上所述，AUREO1b目前最准确的描述是色素生物合成的强候选调控因子，其直接靶标和功能必要性尚待确立。光照方案与转录因子过表达可检测表型效应之间潜在的紧密相互依赖性未在本研究中探索。同时共过表达多个转录因子可能产生MEP途径和类胡萝卜素生物合成通量的协同增加，将此类转录因子组合与叶绿体中异源类异戊二烯合成途径的引入相结合可进一步扩增萜类化合物产量，使硅藻成为工业生物合成的稳健可持续平台。