西瓜花-卷须突变基因Clftm的遗传定位

《Horticulturae》：Genetic Mapping Reveals a Flower-and-Tendril Mutation (Clftm) in Watermelon (Citrullus lanatus L.)

　　

在植物器官发生研究中，花发育是一个突出的模型系统。研究人员在西瓜中发现了一种自然突变，该突变同时将雄花和雌花转变为萼片，并将正常卷须的顶端转变为幼叶。研究人员通过该突变的姐妹系近交创制了正常西瓜自交系和杂交系。研究人员鉴定出一个控制该突变的隐性单基因，命名为Clftm（花-卷须突变，flower-and-tendril mutation）。根据BSA-seq（混合分组分离测序分析，bulked-segregant analysis sequencing），候选区域位于第3号染色体3.12至4.25 Mb之间。随后，研究人员利用56个CAPS（酶切扩增多态性序列，cleaved amplified polymorphic sequences）标记、4个SSR（简单重复序列，simple sequence repeats）标记和6个SNP（单核苷酸多态性，single nucleotide polymorphism）标记等主要标记进行精细定位，将候选基因定位于第3号染色体4.08–4.19 Mb的110 kb区域内。尽管将该位点限定于该110 kb区间内，但未能在其中鉴定出候选基因。研究人员利用F₂群体和20份西瓜种质资源，发现了一个与西瓜花-卷须突变紧密连锁的SNP标记。该研究为未来花发育和花器官形成研究提供了新的见解。

**研究背景与意义**

植物生殖通过花器官完成，花器官发育研究是理解植物发育和花进化不可或缺的内容。经典ABC模型及扩展的ABCE模型表明，四类花器官由四类同源基因协同决定：萼片由A类和E类基因决定，花瓣由A、B和E类基因决定，雄蕊由B、C和E类基因组合决定，心皮由C和E类基因决定。除器官身份基因外，参与边界形成和/或分生组织活性的基因也影响花发育与结构，如WOX转录因子在多个植物的器官融合和侧向发育中起关键作用，CLAVATA基因、PAN、WUS、STM和UFO等参与分生组织中花数目和形状的调控。然而，控制花形成与发育的分子机制仍不完全清楚，尤其是对不同侧向器官具有多效性影响的突变体。

西瓜（*Citrullus lanatus* (Thunb.) Matsum. & Nakai）属于葫芦科，有11条染色体（2n = 2X = 22），参考基因组约425 Mb。西瓜参考基因组'97103' v1于2013年测序发布，随后发布了'Charleston Gray'参考基因组'97103' v2，使下一代测序和功能基因精细定位成为可能。迄今已有一些西瓜花器官突变体的报道，如gms（无毛雄性不育）、ms-dw、ms-2、ms-3等。西瓜开花模式主要有两种：最常见的是雌雄同株，另一种是雄花和两性花同株。然而，西瓜花发育机制受到的关注较少，已知*CitACS4*（一个乙烯生物合成基因）可将雌花转变为两性花，*ClTFL1*调控花序结构和卷须发育，还有一些miRNA及其靶基因与雄性不育相关。

罕见功能变异最初以极低频率出现，可通过迁移、选择和遗传漂变等进化力量变为常见变异。尽管已在多种作物和模式植物中构建了全基因组变异图谱，但植物基因组中的罕见功能变异仍研究不足。本研究中Clftm正是这样一个罕见变异。研究人员采用BSA（混合分组分离分析，bulked-segregant analysis）方法成功定位了控制该罕见功能突变的基因Clftm，候选基因可能位于第3号染色体110 kb基因组区域内，并鉴定出与Clftm相关的位点和连锁标记。该研究为未来Clftm的图位克隆奠定了基础，并为西瓜花和卷须发育的遗传调控提供了新见解。

**关键技术方法**

研究人员以西瓜自交系'RT-8'中鉴定的自然突变Clftm为材料，通过突变杂合姐妹系（Aa）自交，从后代中选择正常系（AA）和杂合系（Aa），正常自交系自交产生纯合群体，杂交系自交产生F₂分离群体，并以正常自交系与杂合系杂交创制BC₁群体。F₂植株在2023年春季、2023年秋季和2024年春季三次实验中种植调查，分别含1385、497和910个F₂单株，100个纯合单株和265个BC₁单株仅在2024年春季种植调查。研究人员利用扫描电子显微镜（SEM）观察萼片和卷须的形态特征；采用CTAB法提取F₂群体新鲜叶片基因组DNA，构建正常池（N-pool）和突变池（M-pool）进行BSA-seq，用Illumina Genome Analyzer IIx测序，计算SNP-index和Δ(SNP-index)定位候选区间；开发CAPS、SSR和SNP标记进行精细定位和连锁检验，其中SNP基因分型采用高分辨率熔解曲线（High-Resolution Melting）分析。

**研究结果**

*西瓜花-卷须突变的遗传与形态特征*：花突变与卷须突变紧密连锁，即花突变时卷须必然突变。扫描电镜观察显示，正常卷须表面光滑，而突变卷须上分布许多毛状体；正常系与突变系萼片的形态特征相似。这些结果表明该突变不仅将花转变为萼片，还导致卷须形状变化。三个F₂群体中花和卷须表型完全共分离，χ2检验显示所有三个群体的分离比均符合3:1，表明Clftm是质量性状，由隐性单基因调控。

*通过BSA-seq将Clftm基因定位在第3号染色体*：研究人员从2023年秋季两个群体中分别选取30个正常个体（N-pool）和30个突变个体（M-pool）进行BSA-seq，测序深度30×，覆盖度>99%，获得33.753 GB原始数据，N-pool和M-pool分别获得106,831,721和110,242,117条短读长，共鉴定333,859个SNP。两个池均为纯合（一个显性纯合、一个隐性纯合），第3号染色体3.12–4.25 Mb区间和第7号染色体29.46–29.84 Mb区间的平均Δ(SNP-index)高于0.9。第7号染色体上的位点通过10个CAPS标记被排除，仅第3号染色体3.12–4.25 Mb区域显示两池间显著差异，证明控制花-卷须突变的候选基因位于第3号染色体3.12–4.25 Mb区间。

*CAPS和SNP标记分析将Clftm缩小至110 kb区间*：研究人员利用2023年春季实验的1385个F₂个体进行分离比分析，开发了第3号染色体的56个CAPS标记、6个SNP标记和4个SSR标记以及第7号染色体的10个CAPS标记，共76个标记用于1385个F₂个体的多态性分析。第7号染色体29.46–29.84 Mb的10个CAPS标记在497个F₂个体中均无多态性，表明该位点在定位群体中为纯合，被排除为Clftm位点。利用第3号染色体的标记，鉴定出控制花-卷须突变的区间位于CAPS050和SNP12之间，物理位置为第3号染色体3.89–4.19 Mb。通过对3.89–4.19 Mb区域内3个F₂重组体的SNP单倍型分析，最终将Clftm基因缩小至CAPS055（4.08 Mb）和SNP12（4.19 Mb）之间的110 kb区域。该110 kb区间内注释有12个基因，研究人员检查了这12个基因的外显子区域，但未发现候选突变，非编码区和启动子区在本研究中未完全测序。

*一个SNP标记与Clftm连锁*：CAPS055和SNP12之间有10个标记，包括1个CAPS标记、4个SSR标记和5个SNP标记。所有这些标记用于检测2023年春季1385个F₂个体的多态性。发现用于Clftm标记辅助选择的标记SNP11与Clftm紧密连锁，该标记也在2024年春季910个F₂群体个体中得到验证。该标记用于筛选20份西瓜种质资源，20份西瓜种质的基因型均为显性，与正常西瓜表型完全吻合。这些结果表明SNP11标记与Clftm紧密连锁，可转化为CAPS/dCAPS/KASP标记用于未来育种项目的常规基因分型。

**讨论与结论**

传统QTL定位通常需要开发大量分子标记并对定位群体中每个个体进行基因分型和表型鉴定，费时费力。近年来，许多作物参考基因组的可用性结合下一代测序（NGS）技术大大加速了基因定位并提高了基因分型效率。NGS辅助的BSA为鉴定与目标基因/QTL连锁的标记提供了一种有效且简化的方法，因为它劳动强度较低、成本效益较高，且基本不受群体大小的限制，仅需分离群体中足够数量的极端表型个体。

本研究中，自然突变Clftm在西瓜纯合自交系'RT-8'中鉴定，所有花（雌花和雄花）变为萼片，正常卷须顶端变为幼叶。基于两年F₂和BC₁群体的栽培实验，研究人员确定该突变由隐性单基因（Clftm）控制。利用F₂分离群体（N = 1385）和66个分子标记，最终将Clftm定位到CAPS055和SNP12标记之间的110 kb区域。由于该区间内没有更多SNP和Indel标记，定位区域无法进一步缩小。

对于110 kb区间内未发现候选基因，可能有几种解释：第一，参考基因组的组装质量可能不够，一些关键基因可能被遗漏；第二，可能存在尚未注释的控制花发育的新基因；此外，非编码调控元件（如启动子、增强子和内含子）中的突变，或基于SNP方法未能捕获的结构变异（包括大片段插入/缺失、倒位和重复），也应考虑在内。由于BSA-seq流程基于SNP检测，110 kb区域内的此类变异未被系统分析。为鉴定因果变异，未来研究应包括两种基因型整个区域的靶向全长测序、长读长重测序和具有多个生物学重复的RNA-seq，甲基化分析也可能有助于揭示该突变背后的表观遗传调控。

大多数突变体研究材料通过EMS诱变创制，而本研究中研究人员通过自然突变获得了花-卷须突变（Clftm）的西瓜突变体。自然自发突变是种质库和育种项目的宝贵资源，因为它们通常代表自然存在的等位基因，可能比诱导突变更具适应性或更稳定。Clftm突变体不仅为研究花和卷须发育提供了模型，还丰富了未来育种可用的西瓜种质。

与性状紧密连锁的标记是首选的标记类型，因为标记与性状之间没有重组。基于110 kb区域，研究人员开发了SNP标记（SNP11）用于检测910个F₂个体和20份西瓜种质的多态性。该标记为西瓜育种项目中的标记辅助选择（MAS）提供了实用工具，特别是用于Clftm性状的早期筛选。

作为被子植物的基本特征，花形成在过去几十年中已被广泛研究。花起源于茎顶端分生组织（SAM），这是茎尖的一种特化结构，由一群不断分裂和自我补充的干细胞组成。在拟南芥中，花器官身份由三类基因（A、B和C）的组合类型决定：萼片身份由A功能（AP1和AP2基因）决定；花瓣身份由B功能（AP3和PI基因）连同A功能决定；雄蕊身份由B功能加C（AG基因）决定；心皮身份由C功能决定。本研究中，110 kb候选区间内没有与花发育相关的基因。研究人员推测有两个原因：一是参考基因组的组装不够好，一些更关键的基因可能被遗漏；二是可能存在一些控制花发育的新基因。

总之，尽管在110 kb区间内未鉴定出候选基因，但该研究为未来花发育和花器官形成研究提供了新见解。所开发的紧密连锁SNP11标记为西瓜育种项目中的标记辅助选择（MAS）提供了实用工具，特别是用于Clftm性状的早期筛选。

研究结论部分译为：本研究中，研究人员确定花-卷须突变由隐性单基因（Clftm）控制。根据基因定位，研究人员成功将Clftm限定于110 kb区间；开发了一个与该突变紧密连锁的标记SNP11，用于鉴定西瓜花-卷须突变。这些发现通过最终帮助培育具有理想价值的西瓜品种，为现有西瓜花-卷须突变知识增添了重要信息。